DTT誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

周子薦,沈璐妍,劉遠(yuǎn)達(dá),全成實(shí)*

(1.吉林大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021;2.吉林大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系; 3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 胃腸營養(yǎng)及疝外科)

研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥的敏感性與其細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有著十分密切的關(guān)聯(lián)[1]。在化療藥物的作用下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到破壞，蛋白質(zhì)無法折疊或錯(cuò)誤折疊，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[2]。DTT(二硫蘇糖醇)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，可阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基的氧化，干擾PDI(二硫鍵異構(gòu)酶)在蛋白質(zhì)二硫鍵形成中的催化作用，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的蛋白大量堆集[3]，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此，本實(shí)驗(yàn)選用DTT誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并進(jìn)行線粒體應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、線粒體ROS水平和細(xì)胞凋亡蛋白檢測。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑與儀器人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44，購于上海子實(shí)生物公司。二硫蘇糖醇(DTT)購自北京coolaber公司，Caspase-3 活性檢測試劑盒購自上海碧云天公司。GRP78蛋白抗體購自proteintech公司；CHOP購自abcam公司；β-actin、PDI、HSP10、HSP60、ClpP、LON、Htr A2/Omi抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 細(xì)胞培養(yǎng):使用10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持飽和濕度。細(xì)胞培養(yǎng)每3天進(jìn)行一次傳代，細(xì)胞使用0.01M PBS沖洗一次，0.25%胰酶細(xì)胞消化，并按照1∶3的比例進(jìn)行傳代。藥物處理：取對數(shù)期生長細(xì)胞，設(shè)置空白對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組采用DTT(5 μmol/ml)分別處理3 h，6 h，12 h及24 h。

1.2.2MTT比色法檢測 96 孔板接種為1.0×104細(xì)胞/孔，細(xì)胞用含10%小牛血清的正常培養(yǎng)液混勻，每孔終體積為100 μl，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育過夜。設(shè)置3個(gè)陰性對照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按實(shí)驗(yàn)所需加藥物處理，每孔終體積為100 μl。到作用時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后，再往每孔加入10 μl MTT，孵育4-6 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO?？装逶谄桨逭袷幤魃险袷?5-10 min。酶標(biāo)儀490 nm波長測取吸光度值，記錄結(jié)果，計(jì)算抑制率或存活率。

1.2.3細(xì)胞線粒體ROS水平檢測 細(xì)胞接種于6孔板上，分組處理同1.2.1。以1∶1000 Mito-SOX Red染色30 min，消化、收集細(xì)胞，充分洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4Western Blot 消化、收集處理的細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，裂解充分后以14 000 g、4℃離心20 min，取上清為細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量后，使用裂解液調(diào)平后，按照1∶4體積比例加入5×Loading Buffer，100℃煮沸 10 min。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果計(jì)算樣品的上樣量，每孔總蛋白25 μg，選用12% SDS-PAGE凝膠和Tris-甘氨酸電泳緩沖液電泳，室溫穩(wěn)壓100V電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉搖床2 h，TBST洗膜，加入按要求稀釋的對應(yīng)的單克隆抗體，4℃封閉孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜后，發(fā)光、凝膠成像系統(tǒng)拍照，結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行量化分析。

1.2.5Caspase 3活性檢測 使用碧云天公司的Caspase-3活性檢測試劑盒，按照試劑盒提供的說明書操作規(guī)范步驟，檢測細(xì)胞裂解液中Caspase-3酶活性。

P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DTT對腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤系SHG44細(xì)胞活性及凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，通過MTT法檢測DTT對細(xì)胞增殖能力的影響，研究發(fā)現(xiàn)高濃度的DTT可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力;凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3活性逐漸上升(P<0.05)。

2.2DTT對腦膠質(zhì)瘤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響

與對照組相比，PDI表達(dá)量較對照組逐步下降(P<0.05)，GRP78/Bip的表達(dá)有顯著升高，且表達(dá)的升高呈時(shí)間依賴性(P<0.05);CHOP表達(dá)水平相對于對照組隨藥物處理時(shí)間延長逐漸上升(P<0.05)，如圖2。

A：MTT檢測結(jié)果量化圖；B：Caspase 3活性檢結(jié)果量化圖(*表示與con組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05)。

A：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Western blot條帶圖；B：GRP78蛋白水平量化圖；C：PDI蛋白水平量化圖；D：CHOP蛋白水平量化圖(*表示與con組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05)。

2.3DTT對腦膠質(zhì)瘤線粒體內(nèi)ROS及線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，線粒體內(nèi)部ROS水平呈時(shí)間依賴性升高(P<0.05)，如圖3。與對照組相比，熱休克蛋白10在3 h表達(dá)量最高，隨后表達(dá)逐漸下降。熱休克蛋白60以及蛋白水解酶LON,ClpP等與對照組相比都呈現(xiàn)出逐漸上升趨勢(P<0.05)，在到6 h達(dá)高峰后表達(dá)開始逐漸下降。且以上熱休克蛋白，蛋白水解酶在24 h組表達(dá)水平均低于對照組的表達(dá)量(P<0.01)。Omi的表達(dá)量則逐漸下降(P<0.01)，如圖4。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤作為成人中樞系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有極高的侵襲性，手術(shù)難以將其徹底清除。膠質(zhì)瘤的較強(qiáng)的增殖能力使其常常處于缺氧、營養(yǎng)缺乏等多種不利環(huán)境中，為應(yīng)對這些不利因素，膠質(zhì)瘤細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)各類應(yīng)激反應(yīng)來重建細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[4]。近年來發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過激活未折疊蛋白反應(yīng)的ATF6，IRE1和 PERK信號通路參與腫瘤化療藥物的耐藥機(jī)制[5]。然而過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可以激活PERK-eIF2α-ATF4信號途徑下游分子CHOP的表達(dá)增加，增加凋亡基因表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡[6]。

A：對照組；B：DTT處理3 h后；C：DTT處理6 h后；D：DTT處理12 h后

A：線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白Western blot條帶圖；B：HSP10蛋白水平量化圖；C：HSP60蛋白水平量化圖；D：ClpP蛋白水平量化圖；E：LON蛋白水平量化圖；F：Omi蛋白水平量化圖(*表示與con組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05，* *P<0.01)。

在本研究中，隨著DTT處理SHG44細(xì)胞時(shí)間的增加，PDI的水平逐漸下降(圖2 C)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78的表達(dá)逐漸增加(圖2 A)。表明DTT抑制了PDI表達(dá)，干擾了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白二硫鍵形成，進(jìn)而誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。同時(shí)隨著DTT處理時(shí)間的延長，信號通路PERK-eIF2α-ATF4下游分子CHOP的表達(dá)在逐漸上升(圖2 C)，凋亡蛋白Caspase-3的活性也逐漸升高(圖1 A)。由此可見，DTT可誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并可通過激活CHOP表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體不僅存在物理上的連接，兩者在Ca2+信號傳遞、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、線粒體分裂融合以及能量代謝等功能上也有著極其緊密的聯(lián)系[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白的聚集，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)平衡，致使線粒體鈣超載，增加了線粒體中ROS的產(chǎn)生[8,9]。大量ROS可以引起線粒體內(nèi)部的未折疊蛋白堆積，發(fā)生線粒體應(yīng)激反應(yīng)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在DTT作用下，線粒體內(nèi)部的ROS水平隨著應(yīng)激水平上升而不斷上升(圖3)。表明線粒體內(nèi)部已經(jīng)無法處理其內(nèi)部大量的ROS，線粒體自身功能已經(jīng)遭到嚴(yán)重?fù)p害。

線粒體內(nèi)部存在多種分子伴侶，它們可以通過各種方式的組合幫助線粒體內(nèi)多肽正確折疊。線粒體基質(zhì)蛋白折疊和修復(fù)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分是由2個(gè)HSP60七聚體和1個(gè)HSP10七聚體所組成的高分子量聚合物[11]。在線粒體應(yīng)激時(shí)，HSP10、HSP60的表達(dá)會(huì)增加，以此減少線粒體內(nèi)部的未折疊蛋白來維持線粒體的穩(wěn)態(tài)[12]。因此在本研究中我們使用HSP10和HSP60作為衡量線粒體應(yīng)激程度的指標(biāo)。結(jié)果顯示，隨著DTT作用時(shí)間延長，HSP10與HSP60都呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(圖4 B、C)。因此我們認(rèn)為在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘發(fā)線粒體應(yīng)激，并且隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加劇，線粒體未折疊蛋白反應(yīng)不足以使線粒體恢復(fù)正常功能，線粒體處于功能失代償狀態(tài)，進(jìn)而線粒體應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)下降。

為了進(jìn)一步評價(jià)對于線粒體應(yīng)激水平，我們又檢測了相關(guān)的線粒體蛋白水解酶表達(dá)變化。ClpP是位于線粒體基質(zhì)中的一種包含絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)域的蛋白水解酶,可利用ATP提供的能量將蛋白底物去折疊,對蛋白進(jìn)行降解[13]。同樣定位于線粒體基質(zhì)的Lon也屬于作為絲氨酸蛋白酶家族成員,可以對疏水氨基酸的末端進(jìn)行水解，通過介導(dǎo)異常或損傷的蛋白和短暫調(diào)控蛋白的降解來維持線粒體的蛋白穩(wěn)態(tài)[14]。結(jié)果所示，隨著DTT作用時(shí)間延長，蛋白酶ClpP和LON總體上也呈現(xiàn)出了先上升后下降的趨勢(圖4 D、E)。而定位在線粒體內(nèi)膜間隙的HtrA2/Omi 是一種寡聚絲氨酸蛋白酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，由線粒體定位序列 MTS引導(dǎo)進(jìn)入線粒體中，并儲(chǔ)存在線粒體膜間隙。它能夠識別錯(cuò)誤折疊蛋白暴露出來的疏水表面，發(fā)揮分子伴侶的功能[15]。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，Omi蛋白從3 h就已經(jīng)開始呈現(xiàn)下降趨勢(圖4 F)。這說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激確實(shí)誘導(dǎo)了線粒體應(yīng)激，并且線粒體內(nèi)膜間隙蛋白穩(wěn)態(tài)失衡的發(fā)生可能先于線粒體基質(zhì)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡。

綜上，我們認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激，且線粒體應(yīng)激可能存在一個(gè)代償閾值，超過此閾值會(huì)使線粒體穩(wěn)態(tài)失衡，其具體表現(xiàn)為分子伴侶水解酶的表達(dá)下降以及蛋白水解酶釋放等，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，線粒體應(yīng)激在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中具有重要作用，進(jìn)一步研究線粒體應(yīng)激在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用為腦膠質(zhì)瘤的化療藥物提供了新治療策略和研究靶點(diǎn)。