茄科勞爾氏菌單克隆抗體的制備及其特性鑒定

馬 蘭， 曾海娟， 謝曼曼， 胡 謙， 丁承超， 王淑娟， 翟緒昭， 孫靜娟， 李 杰， 王 艷， 董慶利， 劉 箐

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海 200093)

茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum，RS) 菌體呈短桿狀，革蘭陰性菌，屬于假單胞菌科，勞爾氏菌屬[1]。青枯病菌種內(nèi)變異豐富，按不同的宿主范圍分為5個不同的生理小種[2]，分別侵染馬鈴薯、煙草，海里康、香蕉，馬鈴薯、番茄，姜和桑樹。RS因廣泛分布于各種地區(qū)，可引起番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科蔬菜的青枯病害，成為多種農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因。作為土傳性細(xì)菌，RS能隨土壤、灌溉水及宿主植株繁殖材料傳播擴(kuò)散，植株病害癥狀往往是發(fā)病晚期才顯現(xiàn)，如若在侵染初期加強(qiáng)對 RS的檢測，及時限制或清除病原菌，對青枯病的預(yù)防蔓延有重要意義。 目前，青枯病已被許多國家列為檢疫對象，RS的檢測也從傳統(tǒng)的癥狀判斷、微生物分離鑒定發(fā)展到免疫學(xué)如ELISA[3]、分子生物學(xué)診斷如PCR[4-6]。由于設(shè)備限制及技術(shù)要求等因素，當(dāng)前的青枯病實(shí)際檢測多以傳統(tǒng)檢測方法為主，其中微生物分離檢測周期長且效率較低。相比較，免疫分析技術(shù)操作簡便且分析時間短[7-8]。高特異性、高靈敏度的選擇性單克隆抗體是免疫分析技術(shù)成功建立的關(guān)鍵因素之一。本研究選取青枯病菌GIM1.76作為免疫抗原制備抗青枯病菌的單克隆抗體，為后續(xù)建立RS免疫快速檢測技術(shù)提供參考，以期降低番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 ①RS宿主植物為生姜的4號生理小種菌株GIM1.71；RS宿主植物為馬鈴薯的3號生理小種菌株GIM1.74；RS宿主植物為木麻黃的2號生理小種菌株GIM1.76；RS宿主植物為桑樹的5號生理小種菌株RS-5；RS宿主植物為番茄的1號生理小種菌株GMI1000，即RS標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-BAA1114； 桑腸桿菌JX-6、蘇云金芽胞桿菌SYJ。以上菌株均由江蘇科技大學(xué)贈送，選用CPG(Casamino acid- Peptone-Glucose)培養(yǎng)基(葡萄糖5 g，水解酪蛋白1 g，蛋白胨10 g，雙蒸水1 L)培養(yǎng)[9]。②瓜類細(xì)菌性果斑病菌燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29625，野生菌株tw31、SD01、 PLSB1、00-1、99-5、xj112、plsb91，嗜酸菌魔芋亞種 ATCC33996、燕麥?zhǔn)人峋ㄌ厝R蘭亞種NCPPB961、玉米細(xì)菌性條斑菌 ATCC19307，選用腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)。③梨火疫病菌QB0809、XL-4，選用LB培養(yǎng)基加蔗糖后培養(yǎng)。④玉米細(xì)菌性枯萎病菌QB0241、QB0242，選用魏氏培養(yǎng)基(酵母膏3 g,蛋白胨5 g，蔗糖10 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g，抗壞血酸1 g，雙蒸水1 L)培養(yǎng)。⑤水稻細(xì)菌性谷枯病菌QB0017、QB0753、QB0755，選用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 PCR相關(guān)試劑(Taq酶、DNTP、Mg2+、引物) (生工生物工程)； DMEM培養(yǎng)基 (GIBCO公司)；胎牛血清 (上海博升生物)；青鏈霉素混合液、牛血清白蛋白 (Hyclone公司)；聚乙二醇2000、二甲基亞砜、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗、8-AG、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基 (Sigma公司)；液體石蠟、甘油、甲醛、考馬斯亮藍(lán) G250、四乙基乙二胺、過硫酸銨、巰基乙醇、過氧化脲等 (國藥集團(tuán))。

1.1.3 儀器與設(shè)備 PCR儀 (System 9700，美國Applied Biosystems公司)； 凝膠成像儀 (G:BOX Chemi XR，英國Syngen公司)； 純水儀 (Milli-Q Academic A10，美國Millipore公司)； 酶標(biāo)儀 (SpectraMax/N2，美國Molecular Devices公司)；蛋白純化儀 (Biologic LP，美國Bio-Rad公司)；電泳儀 (JY1000C，美國Bio-Rad公司)；微量紫外分光光度計(jì) (NanoDrop2000c，美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 抗原準(zhǔn)備 將5株RS分別接種于滅菌后的CPG液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床增菌，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以擴(kuò)增核糖體基因序列(16S rDNA)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物序列：RS-16S-F：TGTCCGGA AAGAAATCGCAC，RS-16S-R：CAGCACCTGTGTCCACTTTC，理論擴(kuò)增片段大小為616 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。選取GIM1.76于CPG液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)至飽和，離心棄上清后用PBS重懸，選OD600值為0.6(約1×109cfu/mL)時吸入注射器作為小鼠免疫原。

1.2.2 單克隆抗體的制備 ①小鼠免疫：每只小鼠腹腔注射0.3 mL免疫原，2周免疫1次，且第3次免疫1周后，斷尾取血測效價，免疫效果不佳則繼續(xù)免疫。選取效價最好的一只小鼠于沖擊免疫1周后，眼球取血后脊椎脫臼處死小鼠，于超凈工作臺中無菌操作摘取脾臟，研磨沖洗出脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)待細(xì)胞融合。眼球血液先在4 ℃放置后離心取血清，-20 ℃保存，以備檢測抗體效價時作為陽性對照使用。②SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)：融合前一個月用含8-AG的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行SP2/0的復(fù)壯篩選，并培養(yǎng)3代以上。取狀態(tài)良好的SP2/0注射到1周前被液體石蠟刺激的小鼠腹腔內(nèi)(約105個/只)。待小鼠腹部膨大后，取腹水離心，在含8-AG的10% FBS完全培養(yǎng)基中篩選3代后擴(kuò)大培養(yǎng)用做細(xì)胞融合，同時細(xì)胞于液氮罐中保存?zhèn)溆?。③?xì)胞融合及篩選：細(xì)胞融合前一天取健康小鼠的巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層細(xì)胞并鋪滿10塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，為雜交瘤細(xì)胞提供基本的生長條件。 將SP2/0和脾細(xì)胞按1∶ 5的數(shù)量比混合后，逐滴加入1 mL 50%的PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后以約105個/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察待處理。用1×HAT培養(yǎng)基進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選，待細(xì)胞長至70%～80%孔底后，用間接ELISA法對細(xì)胞上清液測定融合效果，選取顯色后OD450數(shù)值高的孔稀釋后進(jìn)行亞克隆。亞克隆過程中改用1×HT培養(yǎng)基進(jìn)一步篩選雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行兩次以上亞克隆，直至細(xì)胞能穩(wěn)定分泌特異性強(qiáng)的抗體。④腹水抗體的制備及純化：采用動物體內(nèi)誘生腹水法[10]，選用健康雌性小鼠腹腔注射液體石蠟。1周后，將擴(kuò)大培養(yǎng)的生長狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞用無菌PBS重懸后，對小鼠進(jìn)行腹腔注射。待腹部膨大后，抽取腹水離心取上清，-20 ℃保存待純化。腹水先用飽和硫酸銨粗提沉淀并透析3次以上，然后用Protien G柱親和層析純化，最后將純化后的抗體用SDS-PAGE進(jìn)行純度分析[11]。

1.2.3 單克隆抗體的特性分析 ①單抗的效價測定：分別對小鼠腹水、純化后的單克隆抗體倍比稀釋后采用間接ELISA法，每個梯度做2個平行，以陽性對照的OD450/陰性對照的OD450大于或等于2.1的最大稀釋比例為該抗體的效價測定值。②單抗的亞型鑒定: 單抗的亞型鑒定按照抗體亞型測定試劑盒說明書進(jìn)行，方法同間接 ELISA法，其中的酶標(biāo)二抗換為所購試劑盒中抗體，測定純化后抗體的亞型類型有IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM。③單抗的特異性鑒定: 采用間接ELISA法，測定抗體與其他4株RS及實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有其他玉米、水稻、水果等農(nóng)產(chǎn)品致病菌株的結(jié)合情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

以引物(RS-16S-F：TGTCCGGAAAGAAATCGCAC，RS-16S-R：CAGCACCTGTGTCCACTTTC)對5株茄科勞爾氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)理論擴(kuò)增片段大小應(yīng)為616 bp。鑒定結(jié)果如圖1所示，5種RS在616 bp處均出現(xiàn)明顯電泳條帶，與設(shè)計(jì)的理論擴(kuò)增片段大小保持一致，說明實(shí)驗(yàn)選用的免疫菌株是RS。

圖1 5種茄科勞爾氏菌的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification of RS

2.2 單克隆抗體的制備及特性鑒定

2.2.1 小鼠血清效價 小鼠第4次免疫后斷尾取血分別倍比稀釋1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000、256 000、512 000、1 024 000、2 048 000倍，健康小鼠血清作為陰性對照，結(jié)果為0.084 09，陽性結(jié)果如表1所示。對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析后知，1、3號小鼠血清效價均是1∶512 000，2、4號小鼠血清效價均為1∶1 024 000，選擇4號小鼠沖擊免疫后做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

表1 小鼠血清效價

2.2.2 細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選 對融合的細(xì)胞進(jìn)行篩選并進(jìn)一步亞克隆，最終得到3株可穩(wěn)定分泌抗GIM1.76菌株的單克隆抗體(1C1B1C2E4、1B3C2G7C12、9D7C5E10F11)的雜交瘤細(xì)胞株，縮記為1C1、1B3、9D7。

2.2.3 小鼠腹水效價 采用間接ELISA法測定1C1、1B3、9D7的腹水抗體效價[12]，陰性對照OD450為0.0618，陽性數(shù)據(jù)如圖2所示。分析處理數(shù)據(jù)可知，1C1、1B3、9D7的腹水效價分別是1∶1 024 000、1∶64 000、1∶256 000。

圖2 小鼠腹水的效價Fig.2 Titers of mice ascites

2.2.4 單克隆抗體的純化及純度分析 小鼠腹水純化后采用SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果如圖3所示，所得3株單抗均無明顯雜蛋白，只有清晰的2條約50 kD的重鏈條帶和26 kD的輕鏈條帶，表明純化效果較顯著。

2.2.5 純化后單克隆抗體的效價 測定純化后抗體的效價，陰性對照OD450為0.060 3，陽性數(shù)值如圖4所示。分析可知，純化后1C1(3.651 mg/mL)、1B3(7.147 mg/mL)、9D7(2.560 mg/mL)的抗體效價分別為1∶32 000、1∶128 000、1∶64 000，抗體蛋白濃度折合成2 mg/mL后，1C1、1B3、9D7對應(yīng)抗體效價大約為1∶17 529、1∶35 819、1∶50 000。

圖3 單克隆抗體SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE result of mice ascites and purified antibodiesM: 蛋白Marker；1：1C1純化前；2：1C1純化后；3：1B3純化前；4：1B3純化后；5：9D7純化前；6：9D7純化后M: Protein markers; 1: Pre-purified antibody-1C1；2: Post-purified antibody-1C1; 3: Pre-purified antibody-1B1；4: Post-purified antibody-1B1; 5: Pre-purified antibody-9D7； 6: Post-purified antibody-9D7

2.2.6 3株單克隆抗體的亞型鑒定 抗體亞型試劑盒測定結(jié)果如表2所示，數(shù)據(jù)表明3株抗體亞型均為IgG1。

表2 抗體亞型測定結(jié)果

2.2.7 單克隆抗體的特異性鑒定 利用間接 ELISA法檢測3株單克隆抗體對5種RS結(jié)合情況如表3所示，1C1和9D7均不能與RS-5結(jié)合，1B3不能結(jié)合1.74和 RS-5。此外，檢測結(jié)果還表明3株單克隆抗體與本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有14株其他玉米、水稻、水果等農(nóng)產(chǎn)品致病菌株均無交叉情況。

表3 抗體的特異性分析

注：“+”表示能結(jié)合，“-”表示不能結(jié)合

3 討 論

由于免疫分析技術(shù)是以抗原抗體的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的，因而制備性能良好的單克隆抗體或者多克隆抗體是免疫分析技術(shù)應(yīng)用于RS檢測的關(guān)鍵。然而，已有研究表明，RS多克隆抗體缺乏足夠的特異性。1988年，Griep等[13]從不同區(qū)域收集了與RS分類上相關(guān)的細(xì)菌和多種腐生細(xì)菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的多抗與其多種菌株都存在交叉反應(yīng)。2016年，白利葉等[14]利用對桑樹有致病性的 RS菌株G12-50在胞內(nèi)合成后 分泌并吸附在細(xì)胞壁周圍的重要毒力因子-內(nèi)切葡聚糖酶(EGL)制備多克隆抗體，使桑園對青枯菌的檢測更加方便快速、實(shí)用，但此抗體只針對桑青枯病菌。

由于RS具有遺傳多樣性，且具有多種生化型，現(xiàn)在的單克隆抗體不能有效的選擇區(qū)別這些RS菌株。早在1986年，蔡少華等[15]用從番茄、馬鈴薯、姜、油橄欖、甘薯、花生和桑樹上分離的代表3個生理小種的9個RS菌株為抗原，分別以其全菌和胞壁糖蛋白提取物免疫小鼠，獲得兩類雜交瘤細(xì)胞系，但其分泌抗體特異性并不明確。1991年，謝云陸等[16]利用使生姜染病的 RS制備單克隆抗體和多克隆抗體并建立免疫熒光技術(shù)(IF)和 ELISA檢測由RS引起的姜瘟病，該方法漏檢率較高。1992年，謝云陸等[17]又利用使馬鈴薯染病的RS制備單克隆抗體并應(yīng)用IF檢測了RS在馬鈴薯種薯上的潛伏，靈敏度高達(dá)2×103～2×104cfu/mL，然而此抗體只針對使馬鈴薯致病的RS菌株。以上這些研究制備的單克隆抗體由于年代久遠(yuǎn)，RS的種內(nèi)變異豐富，或者對可檢RS覆蓋面不全，又或者可檢RS株不明，使得應(yīng)用性能差。因此本研究致力于制備針對多種RS生理小種菌株特異性強(qiáng)的單克隆抗體。

近年來多種單抗制備技術(shù)如免疫蛋白制備抗體[18-19]、蛋白嵌合抗體制備[20]、轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備抗體[21]等已被開發(fā)應(yīng)用，但由于這些技術(shù)尚未發(fā)展成熟，而且傳統(tǒng)的單克隆抗體制備技術(shù)較成熟、操作簡單，采用全菌免疫可以得到穩(wěn)定性高的特異性抗體，因此，本研究仍然選用傳統(tǒng)的單克隆抗體制備技術(shù)，先是用GIM1.76以0.3%甲醛滅活后免疫4只小鼠，4次免疫后小鼠血清測效價結(jié)果分別為1∶32 000、1∶8 000、1∶4 000和1∶4 000，可能是滅活的植物菌在小鼠體內(nèi)很快被清除，不能引起持續(xù)的免疫刺激，導(dǎo)致整體免疫效果較差。于是重新選擇4只生長狀態(tài)良好的小鼠免疫GIM1.76活菌，4次免疫后小鼠血清效價分別為1∶512 000、1∶512 000、1∶1 024 000和1∶1 024 000，表明活菌可以引起小鼠較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。細(xì)胞融合并經(jīng)多次篩選后，獲得3株單克隆抗體，其中1C1和9D7能夠和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的4株RS特異性結(jié)合，1B3能夠與其中3株RS結(jié)合。3株抗體均與本實(shí)驗(yàn)室桑腸桿菌 JX-6、蘇云金芽胞桿菌 SYJ及實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有11株燕麥?zhǔn)人峋ㄌ厝R蘭亞種、燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N、嗜酸菌魔芋亞種、玉米細(xì)菌性條斑菌，梨火疫病菌 QB0809、XL-4，玉米細(xì)菌性枯萎病菌 QB0241、 QB0242，水稻細(xì)菌性谷枯病菌 QB0017、QB0753、 QB0755均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。這項(xiàng)研究對建立青枯病菌的檢測方法意義重大，為后期開發(fā)青枯病菌檢測試劑盒或試紙條提供了前提條件，也可應(yīng)用于開發(fā)青枯病菌免疫學(xué)檢測的其他相關(guān)技術(shù)，為番茄、茄子、生姜、馬鈴薯等眾多農(nóng)產(chǎn)品青枯病的有效防治提供參考。