枯草芽胞桿菌蛋白質(zhì)表達分泌系統(tǒng)發(fā)展及展望

張大偉， 康 倩

(1.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308；2.中國科學院大學，北京 100049)

1 枯草芽胞桿菌

1.1 枯草芽胞桿菌

枯草芽胞桿菌是常見的桿狀、產(chǎn)芽胞的革蘭陽性細菌，廣泛存在于土壤等自然環(huán)境中。一直以來，枯草芽胞桿菌作為典型的革蘭陽性細菌的模式生物，成為微生物中最為重要的菌種之一。枯草芽胞桿菌，因其模式菌株基因組已完成全部序列測序及部分基因解析[1]，生理生化特征清晰，菌株安全性高及其非致病性，細胞膜結(jié)構簡單及其分泌性良好，不僅被當作基礎生理生化、遺傳研究的模式生物，而且因其有巨大的工業(yè)生產(chǎn)應用潛力，逐漸成為基因表達系統(tǒng)的研究熱點菌株之一[2-4]。

1.2 枯草芽胞桿菌細胞工廠

作為較有潛力應用于工業(yè)生產(chǎn)的微生物菌株之一，相比較于其他菌株，枯草芽胞桿菌具有較為明顯的應用價值及意義。首先，枯草芽胞桿菌是目前解析最為清楚的生物體之一，也是革蘭陽性細菌研究的典型模式生物，對其研究較為廣泛及清晰。1997年，歐洲和日本學者聯(lián)合研究解析了枯草芽胞桿菌模式菌株168的基因組序列，并將其發(fā)表在Nature[5]。在全基因組測序完成的基礎上，后續(xù)針對枯草芽胞桿菌基因解析及生理特性的研究逐漸開展。2003年，枯草芽胞桿菌的必需基因被解析及報道[1]。隨后，枯草芽胞桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控數(shù)據(jù)庫建立及逐漸完善，數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站DBTBS(http://dbtbs.hgc.jp/)可以較為快捷地查詢枯草芽胞桿菌的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控操縱子等一系列信息?？莶菅堪麠U菌的蛋白組學研究，尤其是針對其分泌蛋白的組學研究[6-7]逐漸被報道，以上一系列枯草芽胞桿菌生理性質(zhì)的研究成果成為了對其應用研究的理論基礎。其次，枯草芽胞桿菌具有菌株安全的特性。對于常見的革蘭陰性細菌，如大腸埃希菌，其細胞外膜上的主要成分脂多糖(LPS)，通常被認為是可以引發(fā)人類和哺乳動物發(fā)熱的一種內(nèi)毒素，導致其在食品添加劑產(chǎn)物和藥物產(chǎn)物生產(chǎn)的應用中有所局限。而枯草芽胞桿菌只有一層膜結(jié)構，并不含有內(nèi)毒素隱患，具有一定的安全性，被美國食品藥品監(jiān)督局(FDA, US Food and Drug Administration)認定為是公認安全菌株(GRAS, Generally Recognized As Safe)。另外，枯草芽胞桿菌具有良好的蛋白分泌特性，可以通過改造，使目標蛋白產(chǎn)物進行大量的分泌。以大腸埃希菌為代表的革蘭陰性細菌具有雙層膜結(jié)構，即內(nèi)膜和外膜，所以其胞內(nèi)合成蛋白產(chǎn)物在進行胞外分泌時需要通過兩層屏障，困難較大，因此其蛋白分泌程度較難達到理想水平。而枯草芽胞桿菌只有一層膜結(jié)構，分泌途徑得到較為詳細的解析，所以其有能力進行大多數(shù)蛋白產(chǎn)物的大量生產(chǎn)和分泌。

2 枯草芽胞桿菌蛋白表達

2.1 枯草芽胞桿菌蛋白表達

枯草芽胞桿菌中的蛋白表達過程受到多種元素的調(diào)控，其中主要集中于轉(zhuǎn)錄過程和翻譯過程[8]。在轉(zhuǎn)錄階段的調(diào)控過程主要集中于對啟動子的篩選和優(yōu)化，選擇最優(yōu)的啟動子及調(diào)控其表達的強度，可以最大程度地進行蛋白的活性表達和避免蛋白包涵體的產(chǎn)生。另外在翻譯階段的調(diào)控主要集中于對蛋白序列中RBS的調(diào)控，以及針對后續(xù)分泌中信號肽的選擇，都是枯草芽胞桿菌中蛋白表達系統(tǒng)構建的重要步驟。

2.2 啟動子調(diào)控

對于枯草芽胞桿菌蛋白表達的調(diào)控首先可以從轉(zhuǎn)錄水平進行，在轉(zhuǎn)錄過程中，RNA聚合酶特異性地結(jié)合不同的啟動子，進行相應基因的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶結(jié)構包括了核心酶區(qū)域(α亞基、β亞基、β′亞基、ω亞基)和一個Sigma (σ)因子。其中核心酶結(jié)構為保守結(jié)構，σ因子的作用是介導核心酶識別和結(jié)合至轉(zhuǎn)錄起始位點上，因為表達基因不同，作用的σ因子的數(shù)量和種類不同，保證了其識別的特異性。枯草芽胞桿菌中σ因子的發(fā)現(xiàn)不斷更新，目前在枯草芽胞桿菌中已發(fā)現(xiàn)多種不同的σ因子，其中σA、σB、σC、σD、σH、σL、σX、σW為枯草芽胞桿菌營養(yǎng)生長因子，σE、σF、σG、σK為芽胞形成因子，其在不同的基因轉(zhuǎn)錄過程中起著調(diào)控作用[9-10]。啟動子作為表達系統(tǒng)的一個重要元件，其有幾個序列區(qū)域高度保守，可以用來預測和分析啟動子。典型的原核啟動子保守區(qū)域包括：-35區(qū)域，序列為TTGACA；-10區(qū)域，序列為TATAAT；-35區(qū)域和-10區(qū)域間17～18個堿基的間隔區(qū)域；轉(zhuǎn)錄起始位點(TTS)。TGn motif(也稱為-15區(qū)域)存在于-17至-14位置，其序列包括TRTG(R代表A或G)。轉(zhuǎn)錄起始位點通常是由嘌呤開始，即A或G。大多數(shù)啟動子的-10至+1區(qū)間通常會有一個富含AT的區(qū)域，本區(qū)域由4～7個堿基構成。-35區(qū)域的上游還有一個UP元件同樣富含AT堿基，并被證明其可以通過和RNA聚合酶的α亞基相互作用，以增強轉(zhuǎn)錄作用。通過修改及優(yōu)化UP元件可以較為明顯地增強啟動子的活性，并進而增強目標蛋白的表達[11-12]。除了根據(jù)上述啟動子的特性進行啟動子優(yōu)化，以提高目標蛋白的表達外，直接進行啟動子的篩選也是一個方便且快捷的蛋白表達的優(yōu)化方案?？莶菅堪麠U菌中可應用的啟動子，依據(jù)其應用方式被分類為組成型啟動子和誘導型啟動子，目前已經(jīng)有許多不同強度的啟動子被報道，本文將對其進行總結(jié)，并描述其特點及應用方式(表1)。

表1 枯草芽胞桿菌蛋白表達系統(tǒng)中常用啟動子

2.3 RBS調(diào)控

核糖體結(jié)合位點(Ribosome-Binding Site, RBS)在枯草芽胞桿菌的蛋白翻譯效率中起著重要作用。據(jù)報道，在移除了RBS的5′端的莖環(huán)結(jié)構[36]，或失活了RBS序列和起始密碼子之后[37]，明顯地減弱了mRNA的半衰期；優(yōu)化RBS序列，可增強mRNA的穩(wěn)定性[38]，表示RBS和mRNA序列穩(wěn)定性有關。所以，對mRNA序列上的RBS序列進行改造，以增強其mRNA的穩(wěn)定性，可以較好地增強蛋白的表達水平，如Phan等[39]通過將lacO轉(zhuǎn)錄操縱子的莖環(huán)結(jié)構和gsiB基因的RBS序列結(jié)合，融合groE基因的啟動子，明顯提升了mRNA的半衰期，從而增加了目標蛋白的表達。

除了對天然的RBS序列進行改造，通過軟件設計人工的RBS序列及對其優(yōu)化也可提高目標蛋白的表達。在統(tǒng)計熱力學平衡模型中，根據(jù)mRNA和30S核糖體之間分子互作的作用力，推算出轉(zhuǎn)錄起始速率。當RBS附近的核酸酶識別位點被初始核糖體覆蓋時，5′核酸內(nèi)切酶的作用被有效抑制，所以mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄起始頻率相關[40]。

2.4 信號肽調(diào)控

在蛋白表達系統(tǒng)中，細胞根據(jù)有無信號肽，對新合成的蛋白質(zhì)進行分選，決定其留在胞內(nèi)作用或轉(zhuǎn)運至細胞膜及細胞外。雖然枯草芽胞桿菌中各種分泌途徑之間略有不同，但其大多數(shù)分泌蛋白的N端信號肽有三個性質(zhì)相似的區(qū)域：一個和轉(zhuǎn)運裝置相互作用，帶正電荷的N端區(qū)域；一個富含疏水殘基的疏水的核心區(qū)域(H區(qū)域)和一個帶有信號肽酶切割位點的C端區(qū)域[7,41]，當?shù)鞍妆贿\送到準確的作用位置之后，信號肽被信號肽酶切除并被降解。N端結(jié)構域和轉(zhuǎn)運元件或細胞膜上帶負電的磷脂相互作用，其結(jié)構中帶有至少一個精氨酸或者賴氨酸的殘基。H結(jié)構域由疏水氨基酸殘基延伸構成，可以在細胞膜中形成α螺旋，在此疏水核心中通常存在發(fā)夾結(jié)構，以便于將完整的信號肽插入細胞膜中從而進行介導作用。C結(jié)構域中存在信號肽酶切割位點，當?shù)鞍淄瓿赊D(zhuǎn)運后，信號肽被信號肽酶切割，從細胞膜上釋放，蛋白正確折疊且成熟。根據(jù)信號肽的結(jié)構特點，一些軟件可以對未知蛋白進行信號肽的預測，其中主要有SignalP和LipoP被廣泛應用。

依據(jù)信號肽參與的分泌途徑不同，將其分類為多種，其中主要有Sec依賴的信號肽、Tat依賴的信號肽、ABC依賴的信號肽和Com依賴的信號肽等。Tat信號肽和Sec信號肽都被信號肽酶I所切割，依賴Sec分泌途徑進行分泌的脂蛋白前體的信號肽被II型信號肽酶切割，假纖毛蛋白(Com依賴型分泌)的信號肽被ComC信號肽酶切割。依賴ABC途徑分泌的核糖體合成外激素和羊毛硫抗生素的信號肽被ABC轉(zhuǎn)運子切割。在枯草芽胞桿菌蛋白表達系統(tǒng)中，通過篩選和優(yōu)化異源蛋白的前導信號肽，可以實現(xiàn)目標蛋白的胞外分泌[42-43]，其不僅可以使目標蛋白導出至細胞外環(huán)境，方便進一步分離純化，也可以減少細胞內(nèi)蛋白的積累壓力，解除部分蛋白表達中的瓶頸抑制，以增加目標蛋白的表達量。

3 枯草芽胞桿菌蛋白分泌

3.1 枯草芽胞桿菌蛋白分泌

在蛋白質(zhì)被合成后，蛋白質(zhì)通過不同的機制被轉(zhuǎn)運到其作用的位置繼續(xù)發(fā)揮生理生化功能。在枯草芽胞桿菌中有多種蛋白分泌途徑來進行新合成蛋白的轉(zhuǎn)運和分泌，其中主要包括經(jīng)典蛋白分泌途徑(Sec分泌途徑)、雙精氨酸分泌途徑(Tat)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ABC途徑)等。除了上述經(jīng)典的分泌途徑外，隨著研究的進展，在枯草芽胞桿菌中越來越多的其他分泌途徑逐漸被揭示及解析，但也有很多未知分泌途徑的分泌蛋白被發(fā)現(xiàn)，且分泌途徑未被闡明，上述蛋白被統(tǒng)稱為非經(jīng)典分泌蛋白(圖1)。

3.2 枯草芽胞桿菌蛋白分泌系統(tǒng)

3.2.1 Sec依賴的蛋白分泌途徑 經(jīng)典分泌途徑，又成為Sec依賴的蛋白分泌途徑，或Sec分泌途徑，廣泛存在于生命體中，主要負責未折疊蛋白的轉(zhuǎn)運?？莶菅堪麠U菌中Sec轉(zhuǎn)運元件由至少4個蛋白構成，分別是轉(zhuǎn)運動力蛋白SecA和構成跨膜蛋白復合體的SecY、SecE和SecG蛋白。在Sec分泌途徑中，主要可以分為三個部分：蛋白質(zhì)的分選和靶定，轉(zhuǎn)運，蛋白質(zhì)的成熟和釋放[8，44]。①蛋白質(zhì)的分選與靶定：在枯草芽胞桿菌Sec分泌途徑中，根據(jù)翻譯和轉(zhuǎn)運的關系及時間可分為翻譯共轉(zhuǎn)運和翻譯后轉(zhuǎn)運兩種形式，在翻譯共轉(zhuǎn)運分泌的蛋白靶定過程中，分泌蛋白中高度疏水的信號肽或細胞膜蛋白的N端跨膜結(jié)構在核糖體的出口處被SRP(信號識別因子)所識別。作為高度保守的核糖核蛋白復合物，SRP由scRNA，兩個組蛋白類似蛋白(HBsu)和一個與scRNA相互作用的Ffh蛋白所構成。SRP可以傳送RNC(核糖體-新生肽鏈復合物)至位于細胞膜上的跨膜SecYEG蛋白通道復合物上。SRP的膜相關受體FtsY直接和膜上脂質(zhì)和SecYEG復合物相互作用，帶領新生肽鏈進入SecY通道[45]。在翻譯后轉(zhuǎn)運分泌的蛋白靶定過程中， SecA蛋白和新合成的多肽鏈相互作用。secA是一個保守的ATP酶，其廣泛存在于各種細菌中，主要負責介導以ATP和質(zhì)子動力勢PMF為能量來源的分泌蛋白，將其引導向細胞內(nèi)膜的SecYEG分泌通道蛋白[46]。實驗結(jié)果證明，刪除SecA的C端區(qū)域可以增加枯草芽胞桿菌中異源蛋白的胞外分泌[47]。②蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運：在Sec分泌途徑中，細胞膜上跨膜的SecYEG蛋白復合體，副轉(zhuǎn)運蛋白SecDF-YajC和跨膜蛋白YidC蛋白共同構成了完整的細胞膜上Sec分泌途徑的蛋白轉(zhuǎn)運子結(jié)構[46]。在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運過程中，SecYEG形成轉(zhuǎn)運通道，SecA催化ATP水解，為蛋白跨膜提供能量。在蛋白轉(zhuǎn)運過程中，對蛋白通道SecYEG進行人工過表達可以增加轉(zhuǎn)運子的數(shù)量，從而增加活性蛋白的分泌量[48]。SecDF蛋白是Sec蛋白分泌途徑中的輔助蛋白，針對蛋白的序列分析和拓撲學分析表示這兩個蛋白是有大的胞外loop環(huán)的完整蛋白，SecDF蛋白在蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運的后期有輔助作用。③蛋白質(zhì)的成熟與釋放：當?shù)鞍踪|(zhì)完成轉(zhuǎn)運時，信號肽酶對蛋白質(zhì)N端信號肽進行切割，從而形成成熟的蛋白質(zhì)。在枯草芽胞桿菌中，信號肽酶分為兩種，I型信號肽酶(Lep)針對大多數(shù)分泌蛋白進行信號肽的切割，II型信號肽酶對脂蛋白的信號肽進行切割。針對I型信號肽酶(SipS、 SipT、 SipU、 SipV、 SipW)進行分析，發(fā)現(xiàn)SipS和SipT兩個信號肽酶的存在就足以處理前體蛋白的成熟和維持細胞的活性，其余信號肽酶發(fā)揮補充作用以滿足不同分泌蛋白的成熟過程，如SipW信號肽酶被證明是雙功能信號肽酶，其需要對孢子生成相關蛋白TasA進行加工處理，也會控制表面附著生物膜的形成?？莶菅堪麠U菌中存在II型信號肽酶LspA，負責脂蛋白信號肽的切割，但是實驗證明，在缺少II型信號肽酶的時候，枯草芽胞桿菌在實驗室環(huán)境下的生長并沒有明顯被影響[8]。轉(zhuǎn)運完成之后，信號肽酶針對分泌蛋白信號肽上的C端區(qū)域中的信號肽酶切割位點進行切割，蛋白被釋放，且由于信號肽結(jié)構對蛋白折疊的延遲作用被解除，蛋白進行進一步折疊與成熟。

圖1 枯草芽胞桿菌中蛋白表達和主要分泌途徑Fig.1 Protein expression and main secretion pathway in Bacillus subtili1：依賴SRP的共翻譯轉(zhuǎn)運途徑；2：Sec依賴的翻譯后轉(zhuǎn)運途徑；3：Tat依賴的蛋白轉(zhuǎn)運途徑；4：ABC轉(zhuǎn)運子依賴的轉(zhuǎn)運途徑；5：非經(jīng)典蛋白分泌途徑1：Co-translation protein secretion with the assistance of SRP; 2：Post-translation protein secretion in Sec-depended pathway; 3：Tat-depended protein secretion pathway; 4：ATP-binding cassette (ABC) transporters secretion pathway; 5：Non-classical protein secretion pathway

3.2.2 Tat依賴的分泌途徑 區(qū)別于Sec蛋白轉(zhuǎn)運途徑，Tat蛋白分泌途徑主要負責折疊蛋白的轉(zhuǎn)運，其負責轉(zhuǎn)運的底物蛋白包含一個保守的雙精氨酸信號肽序列。在Tat蛋白分泌途徑中，參與氧化呼吸鏈的輔助因子和復雜氧化還原酶在蛋白轉(zhuǎn)運過程中起著重要作用。Tat分泌途徑通過TatC和TatA蛋白(或TatA類似蛋白)形成對接復合物，對接復合物中的TatC元件將底物蛋白插入膜內(nèi)，底物-對接復合物招募孔洞形成蛋白TatA，細胞膜內(nèi)外的質(zhì)子動力勢PMF提供蛋白轉(zhuǎn)運的所需能源[49]?？莶菅堪麠U菌的Tat分泌元件由兩個蛋白組成，分別是一個小膜蛋白TatA和一個大的膜蛋白TatC。其中TatA蛋白有三個亞蛋白組成，為TatAc、TatAd和TatAy；TatC蛋白有兩個亞蛋白組成，為TatCy和TatCd。兩個TatA蛋白亞基和TatC蛋白亞基組合構成兩個平行的途徑，分別是TatAy-TatCy和TatAd-TatCd途徑，此兩個途徑分別介導不同底物蛋白的分泌且受操縱子的控制表達[50-51]。目前，枯草芽胞桿菌中已發(fā)現(xiàn)的依賴Tat分泌途徑的分泌蛋白有PhoD、YwbN(EfeB)、QcrA、YkuE等[50]。Tat分泌途徑可以將折疊好的蛋白分泌至胞外，降低了生產(chǎn)中蛋白純化的成本，所以針對Tat分泌途徑應用的研究越來越多。Yang等[52]在枯草芽胞桿菌中，將大腸埃希菌來源的N-氧化還原酶TorA的 Tat信號肽融合表達目標蛋白甲基對硫磷水解酶(MPH)，成功實現(xiàn)了該酶在枯草芽胞桿菌中的表達和分泌，其胞外產(chǎn)量可達6.1 mg/L，有較大的工業(yè)應用潛力。Xia等[53]將嗜熱脂肪土芽胞桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶在枯草芽胞桿菌中表達，通過融合表達枯草芽胞桿菌內(nèi)源的磷酸二酯酶的Tat信號肽，實現(xiàn)了異源半乳糖苷酶的表達和胞外分泌，其胞外酶活達到總酶活的44%。

3.2.3 ABC轉(zhuǎn)運原件依賴的分泌途徑 ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運元件存在于從細菌到人類的所有的生物體細胞中，是由多種復雜蛋白組成的家族。ABC轉(zhuǎn)運元件負責很多形態(tài)功能各不相同的底物的吸收和外排。ABC轉(zhuǎn)運元件有較為保守的特點：都有兩個跨膜區(qū)域(TMD)，底物識別位點和兩個作為動力區(qū)域的核苷酸結(jié)合區(qū)域(NBDs)，NBD區(qū)域負責識別幾個較為保守的系列區(qū)域[54]。ABC轉(zhuǎn)運元件在不同的方面發(fā)揮功能。在枯草芽胞桿菌中，Opu家族就是ABC轉(zhuǎn)運元件的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)之一，負責滲透壓誘導的滲透保護器吸收系統(tǒng)。其中，OpuA是主要的甜菜堿吸收系統(tǒng)，表達受細胞內(nèi)外滲透壓的調(diào)節(jié)；OpuB負責膽堿的特異性轉(zhuǎn)運，與OpuA和OpuB不同，OpuC呈現(xiàn)出多底物兼容的結(jié)合性質(zhì)[55]。NatAB操縱子編碼雙基因ABC轉(zhuǎn)運子，參與枯草芽胞桿菌中鈉離子外排[56]，F(xiàn)tsEX ABC轉(zhuǎn)運子在初始產(chǎn)孢階段調(diào)節(jié)細胞的分化[57]。

3.2.4 非經(jīng)典分泌系統(tǒng) 除了嚴格的信號肽介導的分泌途徑以外，在枯草芽胞桿菌中，越來越多的分泌蛋白被證明不依賴已知的信號肽，且沒有可被預測的信號肽區(qū)域，但卻可以大量地被分泌至細胞外，這類蛋白被統(tǒng)稱為非經(jīng)典分泌蛋白。非經(jīng)典的蛋白分泌現(xiàn)象是一種普遍且廣泛存在的行為，對于枯草芽胞桿菌，越來越多的非經(jīng)典分泌蛋白被發(fā)現(xiàn)，且其分泌途徑暫時未被系統(tǒng)地解析。

針對非經(jīng)典分泌蛋白的研究，目前已取得部分進展：根據(jù)細胞生長過程中吸光值的測定和細胞生長狀態(tài)的檢測證明，在蛋白的非經(jīng)典分泌過程中，并不存在大量的細胞裂解現(xiàn)象[58]，且一些細胞自裂解基因如LytC、LytD的敲除實驗[58]，細胞胞內(nèi)、胞外的蛋白組學分析證明[59]，非經(jīng)典分泌蛋白并不是依賴細胞自裂解進行外排的，且其分泌和胞內(nèi)表達水平無明顯線性相關，推測其存在一定的特異性的分泌途徑；針對非經(jīng)典分泌蛋白自身序列及結(jié)構進行研究，發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典分泌蛋白序列的完整性對蛋白的分泌至關重要[60-61]，且非經(jīng)典分泌蛋白傾向于以多聚體的形式存在于細胞內(nèi)外并保持聚體形式進行分泌，并傾向于從細胞的兩極和隔膜區(qū)域進行分泌[61-62]；針對非經(jīng)典分泌蛋白的功能和應用進行研究，發(fā)現(xiàn)部分非經(jīng)典分泌蛋白和細胞的致病性和侵染過程相關[63]，一些非經(jīng)典分泌蛋白還參與細胞對逆境環(huán)境的抵抗過程[64]，且一些非經(jīng)典分泌蛋白已被證實可以被應用于介導所需蛋白的可溶表達和活性分泌[59，65]，未來有一定的應用前景有待發(fā)掘。

4 枯草芽胞桿菌中蛋白表達與分泌的優(yōu)化策略

枯草芽胞桿菌作為革蘭陽性的模式研究菌株，被美國食品藥品監(jiān)督管理局定為一般認為的安全菌株，有很強的學術研究價值及工業(yè)應用價值。以枯草芽胞桿菌作為底盤細胞，除了可以實現(xiàn)多種生物制品如抗生素、嘌呤核苷酸、維生素的制備，更為重要的是可以作為異源蛋白表達和分泌的良好載體，進行所需蛋白產(chǎn)物的生產(chǎn)?？莶菅堪麠U菌作為工業(yè)生產(chǎn)菌株，有生長速度快，所需碳源、氮源廉價且易獲得，遺傳背景清晰，遺傳操作成熟，分泌途徑解析較為清楚，蛋白產(chǎn)物易分泌和純化等優(yōu)點，有較強的生產(chǎn)優(yōu)勢。但是在枯草芽胞桿菌中的異源蛋白表達及分泌過程中，仍然存在一些目前難以解決的問題，如蛋白二硫鍵的形成和蛋白的非正確折疊的問題，所以針對枯草芽胞桿菌中蛋白表達和分泌的改造方法在不斷地探索和進步。

目前針對在枯草芽胞桿菌中的蛋白表達策略和優(yōu)化，主要集中在四個方面，即蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯、轉(zhuǎn)運和折疊?？赏ㄟ^篩選天然啟動子序列和RBS序列[39]，基于序列預測的理性人工改造啟動子序列以增強目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率[11-12，66]，開發(fā)新型蛋白表達系統(tǒng)[22]，以優(yōu)化目標蛋白的表達；通過篩選天然信號肽序列[67-68]，人工半理性的信號肽序列優(yōu)化[69]，發(fā)掘新的蛋白轉(zhuǎn)運途徑以應用[59，65]，來增加目標蛋白的轉(zhuǎn)運效率，使其更易獲得；通過過表達或改造分泌元件[47，70]，以增強目標蛋白的轉(zhuǎn)運效率；通過共表達分子伴侶蛋白[40]，增加目標蛋白的有效折疊；通過對細胞表面構成進行改造，增強目的蛋白的分泌[71-72](圖2)。除了上述針對蛋白表達和分泌過程的改造策略之外，對枯草芽胞桿菌的菌株改造策略也切實可行，如對枯草芽胞桿菌胞外蛋白酶的敲除，可以保證細胞外蛋白的穩(wěn)定性，增加目的蛋白的胞外產(chǎn)量[73]；對細胞全局碳、氮代謝網(wǎng)絡的調(diào)控，可增強目標蛋白的產(chǎn)量[74]；對細胞進行基因組的精減和改造，構建簡化細胞，也被證實可以提高枯草芽胞桿菌中的蛋白生產(chǎn)[75]等。

圖2 枯草芽胞桿菌中蛋白表達分泌優(yōu)化策略及發(fā)展Fig.2 The optimizing strategy and development of protein expression and secretion in Bacillus subtilis

綜上所述，目前針對枯草芽胞桿菌中的蛋白表達和分泌的優(yōu)化策略已逐漸清晰化和系統(tǒng)化，在實際研究和應用中，可根據(jù)目標蛋白的特異性，選擇不同的優(yōu)化策略將其進行組合，模塊化優(yōu)化，逐步提升目標蛋白的表達和分泌水平，實現(xiàn)定制化的枯草芽胞桿菌蛋白表達系統(tǒng)，實現(xiàn)目標蛋白的大量表達及分泌。

5 展 望

枯草芽胞桿菌，作為科學研究中的重要模式菌株，也是酶與蛋白質(zhì)合成的重要工業(yè)生產(chǎn)菌株，有菌株安全、生長速度快、發(fā)酵原料廉價、遺傳背景清晰、遺傳操作手段完善、蛋白可大量分泌易于純化等諸多優(yōu)點。未來，枯草芽胞桿菌蛋白表達系統(tǒng)將在以下研究內(nèi)容中迎來更大的機遇與挑戰(zhàn)。①基因組人工合成技術：將在基因組層面從頭設計蛋白表達分泌途徑及相關因子，新設計的基因組將在細胞生理與代謝方面賦予枯草芽胞桿菌更多新功能，促進基因的遺傳穩(wěn)定及高效的蛋白表達與分泌。②基因編輯技術：分子遺傳學的快速發(fā)展，尤其是CRISPR為代表的基因編輯技術，將會更新枯草芽胞桿菌遺傳改造手段，實現(xiàn)多位點同時編輯，多途徑同時精確調(diào)控等，大大提高菌株改造效率。③宿主與蛋白表達的匹配與協(xié)同：蛋白表達，尤其是異源蛋白表達會給宿主造成細胞生理與代謝的負擔與響應壓力，是優(yōu)化蛋白表達系統(tǒng)的重點與難點之一。針對異源蛋白的表達與分泌，從宿主細胞生理與代謝層面，深刻理解并進行理性改造，將會有效提高蛋白表達效率。④開發(fā)新型調(diào)控系統(tǒng)和新型分泌途徑：另辟新徑，拓展枯草芽胞桿菌蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的功能途徑。包括開發(fā)新型強啟動子，特定信號誘導調(diào)控的啟動子等；開發(fā)新型分泌途徑，例如非經(jīng)典分泌途徑，自誘導分泌系統(tǒng)，可編程分泌系統(tǒng)等。⑤構建人工微小室或擬亞細胞器：含有二硫鍵的蛋白在枯草芽胞桿菌中表達具有很大挑戰(zhàn)，通過對細胞內(nèi)進行簡單分區(qū)或分成小型微室(micro-compartment)，形成不同氧化還原環(huán)境，同時引入促進二硫鍵形成折疊酶，將有望解決含有二硫鍵蛋白的折疊與表達問題(圖2)。最后，隨著合成生物技術的發(fā)展和理念的深入人心，枯草芽胞桿菌的基礎研究和應用技術將會得到更深入的研究和推進，會使其在工業(yè)酶、食品酶及醫(yī)藥蛋白生產(chǎn)領域有更大的應用潛力，逐步成為蛋白質(zhì)合成的優(yōu)勢宿主菌株。