淺談DGGE技術(shù)在食品微生物研究中的應(yīng)用

魏曉恒

摘 要：DGGE（變性梯度凝膠電泳）是在含有從低到高的線性變性梯度的聚丙烯酰胺凝膠中的特異性雙鏈DNA片段的電泳。通過(guò)電泳， DNA片段移動(dòng)到高濃度的變性劑中。當(dāng)雙鏈的DNA在最低變性的標(biāo)準(zhǔn)下，完成最低濃度的變性劑時(shí)，形成部分?jǐn)噫湢顟B(tài)，從而減慢其遷移速率。當(dāng)產(chǎn)生這種變性時(shí)，就會(huì)發(fā)生序列特異性。所以，DGGE在理想的狀態(tài)下，就可以分解成均勻的DNA片段。這種分子標(biāo)記的方式，有非常顯著的效果。它已廣泛應(yīng)用于生物多樣性調(diào)查、遺傳關(guān)系鑒定、基因突變檢測(cè)等專業(yè)，在這篇文章中，對(duì)DGGE技術(shù)的概念，以及研究食品微生物的作用，都進(jìn)行了總結(jié)，為我國(guó)食品安全的發(fā)展提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：DGGE技術(shù);雙鏈DNA;基因檢測(cè)

中圖分類號(hào)：TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）04-0215-02

0 引言

我們?nèi)粘Ｉ钪械拿恳环N食物，都會(huì)包含著不同的微生物。而我們?nèi)粘Ｉ钪?，?duì)食物最普遍的污染就是食品微生物污染。目前的科學(xué)界中，食品微生物污染專業(yè)，以及食品衛(wèi)生專業(yè)，他們主要研究的領(lǐng)域就是，對(duì)食物中微生物生活的環(huán)境以及其群體結(jié)構(gòu)，有害微生物的測(cè)試。在針對(duì)微生物種群結(jié)構(gòu)研究方面，變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electro—phoresis，DGGE）技術(shù)，是現(xiàn)在科學(xué)界中最關(guān)鍵的一種生物學(xué)方式。這個(gè)技術(shù)是在1979年，由Fischer和Lerman提出的，它是一種專門針對(duì)于DNA突變電泳，來(lái)進(jìn)行測(cè)試的方法。這個(gè)方法的的使用，將傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳，以及聚丙烯酰胺凝膠電泳的測(cè)試，其準(zhǔn)確程度提高到了一個(gè)核苷酸殘基的地步。在研究微生物的種群結(jié)構(gòu)時(shí)，1993年Muyzer等人，將DGGE電泳測(cè)試方法運(yùn)用到了里面。他們認(rèn)為在對(duì)自然界中，微生物種群的繁殖和差異性進(jìn)行研究時(shí)，使用這種方面在各方面都對(duì)其有利。DGGE技術(shù)在研究微生物分析生態(tài)學(xué)方面，已經(jīng)得到了普遍的應(yīng)用，其主要特點(diǎn)在于，能夠精準(zhǔn)、迅速的對(duì)自然或者人工環(huán)境中，微生物的群落進(jìn)行判斷，還可以微生物種群的繁衍、物種的興衰、基因等方面，進(jìn)行分析研究。在這篇文章中，對(duì)DGGE技術(shù)的概念，以及研究食品微生物的作用，都進(jìn)行了總結(jié)。

1 DGGE技術(shù)基本原理及操作流程

1.1 基本原理

采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA片段，分子量的變化、穩(wěn)定、中等，以及其16S 核糖體RNA，或者是18S 核糖體RNA。擴(kuò)增之后的DNA片段，其大小是一樣的，但是排布的規(guī)律是有區(qū)別的。在進(jìn)行解離和變性凝膠時(shí)，不一樣的DNA片段，因?yàn)槠涮卣鞯牟町惗环纸?。由于G、C、A、T4堿基在DNA片段中，其排布的規(guī)律存在差異，所以雙鏈DNA分析其溫度上（tm），也存在一定的差異。低濃度變性劑下鏈接低TM DNA分子，在濃度高的變性劑下，就會(huì)鏈接高TM DNA分子，假設(shè)每組堿基都存在差異，那么濃度存在差異的變性劑，就要提供給堿基對(duì)一樣的雙鏈DNA分子。當(dāng)變性劑的濃度適宜時(shí)，雙鏈DNA分子的鏈就會(huì)分解，而鏈停頓的越久，其在移動(dòng)的過(guò)程中受到的阻礙就越多，DNA分子的電泳遷移率越低。當(dāng)遷移電阻與電場(chǎng)力處于均衡的狀態(tài)，在濃度梯度發(fā)生變化的凝膠中，DNA分子就可以存活，所以，存在差異的DNA分子，就是變成獨(dú)立的條帶。

1.2 操作流程

實(shí)施DGGE這項(xiàng)技術(shù)完整的順序如下：（1）采集不同的食物;（2）從樣品中提取和純化總DNA或RNA;（3）可變區(qū)PCR或RT-PCR擴(kuò)增;（4）預(yù)實(shí)驗(yàn)（DGGE條件優(yōu)化）;（5）DGGE凝膠的制備;（6）S的DGGE分析;樣本;（7）光譜分析;（8）對(duì)條帶的分布規(guī)律進(jìn)行研究。這里面在研究的食物中，必須要先將總DNA進(jìn)行提純，其中最重要的環(huán)節(jié)就是對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行設(shè)計(jì)，以及對(duì)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。以上就是對(duì)DGGE技術(shù)的實(shí)行。

1.3 特點(diǎn)

實(shí)行DGGE技術(shù)的原理，首先16S核糖體RNA的引物，對(duì)增大一些細(xì)菌必須有顯著的效果，然后從實(shí)驗(yàn)的食物中，提取出微生物基因組DNA，來(lái)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，然后將增大之后的微生物，使用DGGE技術(shù)來(lái)解離判斷，以此來(lái)對(duì)微生物進(jìn)行研究。DGGE法是研究細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最常用的分子生物學(xué)方法之一，它不需要培養(yǎng)，檢測(cè)限低，測(cè)試的效果明顯，成本低，結(jié)果精確，使用的范圍非常的廣泛。凝膠條帶0/1矩陣、峰矩陣、亮度矩陣分析凝膠圖樣，共同構(gòu)成了DGGE凝膠分析法。在使用DGGE凝膠分析時(shí)，不同的條帶對(duì)實(shí)驗(yàn)的精確會(huì)產(chǎn)生干擾，特別是在分析微生物的種群時(shí)，這種干擾更加明顯。

任何分析生物學(xué)的方法都不可能是完美的，都有需要完善的地方，DGGE技術(shù)也不例外，在分析DNA片段時(shí)，DGGE技術(shù)只能完成一部分，針對(duì)微生物的群落中，不到1%優(yōu)勢(shì)的種群，其在分析過(guò)程中還存在一定的誤差。DGGE技術(shù)在進(jìn)行解離時(shí)，對(duì)大片段沒(méi)有任何作用，這對(duì)系統(tǒng)的分析、獲取排布規(guī)律的信息，都產(chǎn)生了一定的阻礙。針對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的選取各方面而言，要求極其嚴(yán)苛，如果稍有疏忽，分布規(guī)律存在差異的DNA片段，就會(huì)一起進(jìn)行移動(dòng)。種類各異的DNA片段，分布的地方是一條DGGE帶，對(duì)研究對(duì)象的分析，存在一定的誤差。

2 DGGE技術(shù)在食品微生物研究中的應(yīng)用

2.1 食品微生物的多樣性分析

現(xiàn)在的科學(xué)界中，研究食品微生物的方法有很多中，其中最為關(guān)鍵的就是DGGE技術(shù)，它對(duì)測(cè)試研究對(duì)象的微生活種群是至關(guān)重要的，在所有的微生物研究中，得到了普遍的使用。聚類分析（UPGMA）表明不同來(lái)源的樣品中微生物組分的相似性和相關(guān)性。樣品電泳圖譜中的條帶數(shù)目可以反映不同樣品間群落的相似性。通過(guò)計(jì)算群落相似系數(shù)，就能夠發(fā)現(xiàn)生物種群之間的不同之處。在對(duì)微生物的種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究時(shí)，PCR-DGGE技術(shù)得出的結(jié)果是非常精確的，也給食物的安全提供了保障。在水產(chǎn)品、酒類、發(fā)酵食品、肉制品等行業(yè)，得到了普遍的使用。

鄭炯、夏雪娟、葉秀娟等人利用聚合酶鏈反應(yīng)-聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)研究了竹筍的鹽度為5g/100mL和19g/mL的微生物菌群。結(jié)果表明，從鹽濃度較低（5g/100ml）的鹽芽中，經(jīng)DNA提取、套式PCR、DGGE電泳和克隆測(cè)序，分離出4條明顯的亮帶。這些條帶被鑒定為西巴里亞魏氏菌、乳球菌屬、魏氏菌屬、乳酸乳球菌和鹽濃度高的鹽芽（19g/100ml）。從竹筍中分離出5條明顯的亮帶，分別為綠氣球菌、賴氨酸桿菌、未培養(yǎng)細(xì)菌、厭氧桿菌和芽孢桿菌，低鹽腌漬的優(yōu)勢(shì)菌為益生菌，高鹽腌漬的優(yōu)勢(shì)菌為益生菌。具有很強(qiáng)抵抗力的細(xì)菌?；?6S DNA的PCR-DGGE技術(shù)為分析竹筍的微生物多樣性提供了一種可靠、快速、有效的方法。

2.2 食品微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

在同一個(gè)時(shí)間段內(nèi)，研究對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，可以使用DGGE技術(shù)，它對(duì)食品生產(chǎn)、儲(chǔ)存、發(fā)酵的過(guò)程中，各種微生物種群的變化，都進(jìn)行了嚴(yán)格的檢測(cè)。對(duì)食品中微生物種群的變化，能夠在第一時(shí)間內(nèi)，精準(zhǔn)的檢測(cè)出來(lái)，對(duì)食品在工業(yè)化生產(chǎn)、貯藏環(huán)境的設(shè)置等方面，提供了很大的便利，也保障了食品的安全質(zhì)量。所以，在對(duì)微生物種群的研究中，DGGE技術(shù)起著至關(guān)重要的作用。

冉甘橋、張紅巖、任平認(rèn)為，經(jīng)自然積累發(fā)酵預(yù)處理后，葛根總異黃酮的提取率提高了5.7%。然后，采用傳統(tǒng)平板法和PCR-DGGE技術(shù)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中不同階段微生物區(qū)系的變化進(jìn)行了分析，篩選出在發(fā)酵過(guò)程中起主要作用的微生物。結(jié)果表明，自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌數(shù)量呈上升-下降-再上升的趨勢(shì)，溫升期明顯增加，高溫期減少，冷卻期再次增加，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中真菌數(shù)量繼續(xù)增加。

任方方，趙笑，趙凱介紹了，變性梯度凝膠電泳技術(shù)的概念，以及研究動(dòng)物微生物種群的作用，都進(jìn)行了總結(jié)，并且，對(duì)此技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

2.3 食品微生物快速鑒定

DGGE技術(shù)在提取微生物總核酸時(shí)，是從實(shí)驗(yàn)對(duì)象中進(jìn)行的，而不是使用以前的培養(yǎng)方式。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增后，用DGGE獲得條帶，并進(jìn)一步采用種或群特異性。在相同條件下，通過(guò)性探針與所獲得的條帶的雜交、條帶切割和再現(xiàn)后的測(cè)序，或者是與對(duì)照微生物，其DGGE電泳的數(shù)據(jù)，來(lái)直接進(jìn)行對(duì)比，可以在短時(shí)間內(nèi)，判斷出實(shí)驗(yàn)對(duì)象中新生的微生物。

DGGE技術(shù)不依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，直接從食品樣品中提取微生物總核酸。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增后，用DGGE獲得條帶，并進(jìn)一步采用種或群特異性。在相同條件下，通過(guò)性探針與所獲得的條帶的雜交、條帶切割和再現(xiàn)后的測(cè)序，或者是與對(duì)照微生物，其DGGE電泳的數(shù)據(jù)，來(lái)直接進(jìn)行對(duì)比，可以在短時(shí)間內(nèi)，判斷出實(shí)驗(yàn)對(duì)象中新生的微生物。

3 結(jié)語(yǔ)

在研究食品微生物的領(lǐng)域，DGGE技術(shù)的發(fā)展前景非常好。使用這個(gè)技術(shù)，可以在最短的時(shí)間內(nèi)，對(duì)食品成熟時(shí)微生物群落的演替進(jìn)行測(cè)試，而且能有效地評(píng)價(jià)食品原料、中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的質(zhì)量，對(duì)食物在生產(chǎn)時(shí)，能夠進(jìn)行嚴(yán)格的把關(guān)。并且，這個(gè)技術(shù)發(fā)展?jié)摿σ彩菬o(wú)限的，比如：在食品的出處、食品是否有微生物污染、其生長(zhǎng)的地理環(huán)境等。保障了食品的安全質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

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