非降解聚氨酯彈性體支架材料體外構(gòu)建殘耳軟骨用于修復(fù)耳廓組織的可行性

劉戈 楊慶華 張玲 等

[摘要]目的：探討以非降解聚氨酯彈性體支架材料體外構(gòu)建殘耳軟骨用于修復(fù)耳廓組織的可行性。方法：分離30例臨床小兒畸形患者軟骨細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、擴(kuò)增后制成細(xì)胞懸液滴加于圓盤狀聚氨酯支架上，體外培養(yǎng)21d后接種于裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)42d，應(yīng)用掃描電鏡觀察細(xì)胞-支架復(fù)合物生長情況，同時(shí)使用免疫組織化學(xué)法觀察成軟骨細(xì)胞冰凍切片情況。結(jié)果：軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)3周后形成的細(xì)胞-支架復(fù)合物的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)較正常耳廓軟骨組織相差甚遠(yuǎn)，而在裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)6周的細(xì)胞-支架復(fù)合物外觀光滑細(xì)膩，與正常耳廓軟骨組織相近，經(jīng)免疫組織化學(xué)法分析可見新生的軟骨組織細(xì)胞間質(zhì)中存在藍(lán)黑色的絲網(wǎng)狀彈力纖維。結(jié)論：聚氨酯材料能夠成為組織工程耳廓軟骨的支架材料，且體內(nèi)培養(yǎng)較體外培養(yǎng)更利于軟骨組織的生長。

[關(guān)鍵詞]非降解聚氨酯彈性體;組織工程;支架;培養(yǎng);耳軟骨損傷;修復(fù)

[中圖分類號(hào)]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）03-0089-04

Abstract： Objective? To investigate the feasibility of constructing tissue engineered cartilage in vitro by using chondrocytes and non-degradable polyurethane elastomers as clinical scaffolds in vitro. Methods? 30 cases of rabbit chondrocytes were isolated from clinical pediatric malformation. The cell suspension was added to disc-shaped polyurethane scaffold after culture and amplification after vitro culture for 21 days. They were inoculated into nude mice for 42 days. The growth of the cell scaffold complex was observed by electron microscopy. The frozen sections of osteoblasts were observed by immunohistochemistry. Results? The morphology and histology of the cell-scaffold complex formed by chondrocytes cultured for 3 weeks in vitro was much different from that of normal auricular cartilage tissue， while the cell-scaffold complex cultured in nude mice for 6 weeks was smooth and delicate. Similar to the normal auricular cartilage tissue， immunohistochemical analysis showed that there were blue-black mesh-like elastic fibers in the interstitial cells of the new cartilage tissue. Conclusion? Polyurethane material can be used as a scaffold material for tissue engineering auricular cartilage， and in vivo culture is more conducive to the growth of cartilage tissue than in vitro culture.

Key words： non-degradable polyurethane elastomer; tissue engineering; scaffold; culture; ear cartilage injury; repair

先天性畸形、外傷引起的耳廓軟骨損傷不僅增加患者痛苦，還會(huì)影響外觀，不利于患者身心健康[1]。由于耳廓軟骨細(xì)胞代謝緩慢，再生能力低，因此患者耳廓軟骨組織損傷后難以通過細(xì)胞自身修復(fù)達(dá)到理想的效果[2]。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，以可降解性的生物材料作為重建及修復(fù)軟骨組織，能在一定程度上修復(fù)軟骨損傷，改善軟骨組織外觀，但可降解支架穩(wěn)定性較差，其構(gòu)建的細(xì)胞-支架復(fù)合物力學(xué)性能無法持久，仍需要不斷改進(jìn)[3-4]。因此，本研究將探討以非降解聚氨酯彈性體材料制成圓盤狀聚氨酯支架構(gòu)建組織工程軟骨的可行性，旨在為耳軟骨損傷患者臨床修復(fù)提供指導(dǎo)。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 軟骨組織：收集30例臨床耳廓畸形患者耳軟骨組織，材料由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院整形七科提供，組織獲取均經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雌性裸鼠5只，周齡5～6周，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心負(fù)責(zé)飼養(yǎng)。

1.1.3 材料：聚氨酯彈性體材料由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物醫(yī)學(xué)工程系許海燕教授課題組提供;甲苯胺藍(lán)色染色液、多聚甲醛溶液由上海生工生物工程股份公司提供;DAB顯色試劑盒由北京鼎盛生物科技有限公司提供。

1.1.4 儀器：光學(xué)顯微鏡由美國Nikon Corporation公司提供;HM550切片機(jī)由德國Microm公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)：對殘耳進(jìn)行清洗消毒，剪碎至1mm3大小的顆粒，加入0.25%胰酶5ml，在37℃恒溫水浴箱中振蕩消化20min，棄去上清液，加入0.4%膠原蛋白酶5ml，37℃消化300min，過篩收集軟骨細(xì)胞。將收集的耳軟骨細(xì)胞加入10%胎牛血清培養(yǎng)基中，按3×10-8/L的細(xì)胞濃度接種，置于37℃恒溫水浴箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集第二代殘耳軟骨細(xì)胞接種于支架上。

1.2.2 細(xì)胞-支架復(fù)合物的體外及體內(nèi)培養(yǎng)：將二代殘耳軟骨細(xì)胞接種在圓盤狀聚氨酯支架上，隨機(jī)分為3組（A、B、C），A組于接種后24h行掃描電鏡觀察;B組于體外培養(yǎng)3周后行掃描電鏡觀察;C組于體外培養(yǎng)1周后植入裸鼠體內(nèi)，6周后再行掃描電鏡觀察。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)檢測： A、B、C三組軟骨組織培養(yǎng)結(jié)束后于掃描電鏡下觀察軟骨細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)及彈力纖維形成情況，采用10%中性福爾馬林固定軟骨組織24h，經(jīng)石蠟包埋、脫水，制成4～5μm厚切片，依次行HE染色、番紅O染色、彈力纖維染色，觀察組織情況。

2? 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞與材料的粘附情況：軟骨細(xì)胞接種24h后，掃描電鏡下可觀察到圓盤狀聚氨酯支架上細(xì)胞形態(tài)均勻、排列有序、接觸良好，還可見支架空隙內(nèi)軟骨細(xì)胞密集分布，提示軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)已形成。同時(shí)在掃描電鏡下還可觀察到部分細(xì)胞已被基質(zhì)包圍，部分細(xì)胞呈完整圓形、橢圓形或梭形細(xì)胞輪廓（見圖1A，1B）。而在圓盤狀聚氨酯支架截面上可觀察到傳代軟骨細(xì)胞已經(jīng)浸潤支架內(nèi)部，但支架內(nèi)部的軟骨細(xì)胞密度明顯低于支架表面，而且支架內(nèi)部軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)還沒形成或形成不明顯，細(xì)胞多呈圓形分散、聚集、粘附在孔壁上，細(xì)胞間接觸緊密度也不及表面軟骨細(xì)胞緊密度（見圖1C，1D）。

2.2 軟骨細(xì)胞體外3周組織學(xué)染色情況：軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)3周后，經(jīng)HE染色可觀察到支架表面上生長大量軟骨細(xì)胞，而在孔徑為200μm的支架上可見少量的軟骨細(xì)胞聚集，且軟骨細(xì)胞呈陷窩狀（見圖2A，2B），番紅O染色為弱陽性（見圖2C），彈力纖維染色為陰性（見圖2D）。

2.3 軟骨細(xì)胞體內(nèi)6周組織學(xué)染色情況：軟骨細(xì)胞體內(nèi)培養(yǎng)6周后，經(jīng)HE染色可觀察到支架材料與軟骨細(xì)胞形成軟骨組織，但這種新生的軟骨組織形態(tài)較差，組織陷窩，細(xì)胞排列無序，僅在孔徑約200μm的孔隙中可觀察到部分形態(tài)特征并不明顯的軟骨組織（見圖3A～3C）。番紅O染色顯示軟骨細(xì)胞為深紅色，提示軟骨細(xì)胞分泌了大量的酸性蛋白聚糖（見圖3D）。彈力纖維染色顯示軟骨細(xì)胞為藍(lán)黑色，提示細(xì)胞內(nèi)部形成絲網(wǎng)狀彈力纖維（見圖3E）。

3? 討論

合適的支架是決定軟骨組織體外生長的重要因素。在以往研究中，軟骨組織工程支架材料主要采用生物相容性材料制作，軟骨細(xì)胞沿著支架框架進(jìn)行生長，而支架逐步被分解，最終構(gòu)建出由軟骨基質(zhì)及軟骨細(xì)胞形成的軟骨組織[5-6]。然而，這種方法構(gòu)建出來的軟骨組織性能及穩(wěn)定性較差，軟骨組織由于缺乏支架支撐會(huì)影響組織外觀及形態(tài)，由于耳廓屬于人體五官組織，臨床上對其外觀形態(tài)要求較高，因此構(gòu)建出能與自身耳廓媲美的組織工程軟骨是組織工程學(xué)人員重要研究的課題[7]。從以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可知[8-9]，采用可降解材料構(gòu)建的支架會(huì)導(dǎo)致組織工程支架由于無法抵抗皮膚張力而坍陷，從而形成軟骨組織外觀。此外，利用可降解材料作為支架構(gòu)建出的軟骨組織會(huì)存在嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)。Tan等[10]學(xué)者認(rèn)為軟骨細(xì)胞框架材料宜用不可降解材料作為內(nèi)撐材料，這樣不僅能構(gòu)建外觀更為完美的軟骨組織，而且能減少對種子細(xì)胞數(shù)目的要求?；谏鲜鲅芯浚狙芯繑M通過將傳代培養(yǎng)的殘耳軟骨細(xì)胞接種在非降解聚氨酯彈性體材料構(gòu)建的框架上，并利用體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明本次研究的可行性。

非降解聚氨酯彈性體材料因其具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性及優(yōu)良的力學(xué)特性，近年作為再生醫(yī)學(xué)材料被廣泛應(yīng)用于人體各器官研制中，如人體關(guān)節(jié)配件、人體血管、人體氣管等等，在人體組織工程領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用[11-13]。本實(shí)驗(yàn)所用的非降解聚氨酯為聚碳酸型聚氨酯，具有良好的物理學(xué)及化學(xué)穩(wěn)定性，能長時(shí)間穩(wěn)定地存在于人體內(nèi)。與目前臨床上被廣泛應(yīng)用的膨體材料或Medpor假體相比，其在力學(xué)性能及加工特性上更具有優(yōu)勢。由于非降解聚氨酯彈性及柔韌性良好，可根據(jù)耳廓外形制成各種形態(tài)的支架，使軟骨組織最大限度與人體耳廓接近，并在性能上滿足人體耳廓要求，使臨床上耳廓組織損傷完美修復(fù)成為可能[14]。

本研究結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞接種24h后，在掃描電鏡下可觀察到圓盤狀聚氨酯支架上細(xì)胞間密切接觸，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，大量的軟骨組織浸潤在材料表面上，且細(xì)胞間排列有序，緊密接觸，高密度的細(xì)胞接觸更有利細(xì)胞間信號(hào)傳遞，從而更好地發(fā)揮生物學(xué)性能。進(jìn)一步觀察可知，軟骨細(xì)胞向支架內(nèi)部浸潤時(shí)效果并太理想，隨著軟骨細(xì)胞向支架內(nèi)層浸入深入，細(xì)胞數(shù)目及密度逐漸減少。這可能與支架空隙較多及貫通性有關(guān)，更多的空隙率將有助于接種的軟骨細(xì)胞在支架內(nèi)部彌散，有利于細(xì)胞增殖及聚集，同時(shí)也有助于軟骨細(xì)胞攝取培養(yǎng)基營養(yǎng)及排除代謝產(chǎn)物[15]。盡管聚氨酯材料構(gòu)建的支架孔徑大小適合，但孔間貫通性較差，導(dǎo)致接種的軟骨細(xì)胞無法自由地遷移及彌散，影響軟骨細(xì)胞聚集[16]。因此，通過本次研究可知，采用不可降解材料作為構(gòu)建軟骨細(xì)胞框架時(shí)，應(yīng)盡量提高孔隙率，避免阻礙軟骨細(xì)胞生長及細(xì)胞間信號(hào)傳遞。

本研究體外組織實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞接種在支架材料3周后可觀察到淡黃色的類軟骨樣組織，但經(jīng)HE組織學(xué)染色后并沒有觀察到成熟的軟骨細(xì)胞著色，這可能與染色及制片過程中，軟骨細(xì)胞發(fā)生了脫落有關(guān)。此外，軟骨細(xì)胞經(jīng)番紅O染色為弱陽性，彈力纖維染色為陰性，同時(shí)還可觀察到支架內(nèi)部細(xì)胞排列紊亂，軟骨陷窩不明顯，偶見成對的同源細(xì)胞。經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)6周后，在電鏡下可觀察到支架材料上出現(xiàn)明顯的瓷白色軟骨組織，同時(shí)可觀察到排列規(guī)則、形態(tài)良好的軟骨細(xì)胞，經(jīng)HE、番紅O、彈力纖維軟色后細(xì)胞著色明顯，而彌散不均勻的軟骨細(xì)胞經(jīng)HE、番紅O、彈力纖維軟色后并沒明顯變化。導(dǎo)致上述情況出現(xiàn)的可能原因，一方面與軟骨細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)時(shí)間過短有關(guān)，另一方面也與支架材料支架孔徑過大、空隙率過高、貫通性等因素影響細(xì)胞間的相容性和可粘附性能有關(guān)[17]。因此，在構(gòu)建軟骨細(xì)胞生長框架時(shí)不僅需要注重材料的性能，同時(shí)也要考慮材料合適的孔徑大小、高孔隙率及貫通性，這些因素不僅會(huì)影響軟骨細(xì)胞再分化，對調(diào)節(jié)軟骨組織能力有重要作用，而且還會(huì)影響軟骨細(xì)胞彌散及分布，細(xì)胞間信號(hào)交流及細(xì)胞的新陳代謝。

4? 結(jié)論

聚氨酯材料能夠成為組織工程耳廓軟骨的支架材料，且體內(nèi)培養(yǎng)較體外培養(yǎng)更利于軟骨組織的生長，但以后研究中還需要進(jìn)一步改進(jìn)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使其更符合正常耳廓組織性能。

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[收稿日期]2018-11-04

本文引用格式：劉戈，楊慶華，張玲，等.非降解聚氨酯彈性體支架材料體外構(gòu)建殘耳軟骨用于修復(fù)耳廓組織的可行性[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（3）：89-92.