植物甾醇提純與檢測(cè)優(yōu)化研究

許騰 陳文潔

摘 要：本試驗(yàn)以植物甾醇保健品為原料，對(duì)混合植物甾醇進(jìn)行提純精制，并探討優(yōu)化提純方法。其結(jié)果表明：對(duì)以乙醇為提純?nèi)軇庙憫?yīng)曲面法對(duì)提純工藝進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果為：料液比1：32.4，結(jié)晶溫度-9.42℃，養(yǎng)晶時(shí)間6.08h，得率66.20%。氣相色譜分析，四種甾醇單體含量分別為菜籽甾醇3.28%，菜油甾醇17.01%，豆甾醇23.59%，β-谷甾醇43.86%，總甾醇含量為87.75%。植物甾醇在各種有機(jī)溶劑中存在溶解度和吸附力等性質(zhì)差異，同時(shí)，料液比、結(jié)晶時(shí)間和結(jié)晶溫度對(duì)混合植物甾醇得率有明顯影響。

關(guān)鍵詞：植物甾醇;提純;優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ914.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）02-0074-03

本試驗(yàn)運(yùn)用溶劑重結(jié)晶法對(duì)混合植物甾醇進(jìn)行提純，并探討甲醇、乙醇和丙酮三種不同溶劑的料液比、結(jié)晶時(shí)間和結(jié)晶溫度對(duì)混合植物甾醇得率的影響，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化其提純工藝，同時(shí)氣相色譜分析。旨在提供植物甾醇提純與檢測(cè)分析試驗(yàn)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

試劑（均為分析純）名稱(chēng)：甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮以及丙酸酐;植物甾醇（市售保健品）。

試驗(yàn)儀器：HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋;HERATHERM Oven烘箱;SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵;SOP電子天平;Elmasonic P超聲清洗器;7890B氣相色譜儀。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 溶劑選擇和提純

考慮有機(jī)溶劑的安全性、性質(zhì)差異及穩(wěn)定性等因素，本試驗(yàn)選用甲醇、乙醇和丙酮為植物甾醇溶劑進(jìn)行提純。

1.2.2 重結(jié)晶工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00g植物甾醇放置于250mL圓底燒瓶中加入溶劑，用電磁攪拌水浴回流使樣品完全溶解并趁熱過(guò)濾，冷卻靜置后真空減壓抽濾，置于34℃恒溫箱真空干燥、稱(chēng)重，最后計(jì)算晶體得率。

采用響應(yīng)曲面法（Response Surface Methodology，RSM）[3-4]對(duì)重結(jié)晶工藝優(yōu)化。通過(guò)評(píng)估結(jié)晶溫度（℃），料液比（甾醇質(zhì)量/溶劑體積，W/V），養(yǎng)晶時(shí)間（h）三個(gè)單因素對(duì)重結(jié)晶工藝的影響，進(jìn)行三個(gè)因素五個(gè)水平中心組合的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.3 氣相色譜分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00g植物甾醇，加入1%膽甾醇-吡啶溶液5.0mL、丙酸酐3.0mL，水浴攪拌回流（80℃），冷卻后經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾，并置于10mL容量瓶中待衍生化后進(jìn)行氣相色譜分析。色譜柱：DB-5柱（30m×0.25nm×0.25μm）;FID（氫火焰離子檢測(cè)器），溫度300℃;載氣：高純N2，載氣流量75mL/min;進(jìn)樣量1μL;試驗(yàn)時(shí)，在色譜柱柱溫60℃保持2min后，以2℃/min的速度升至100℃，再保持2min后以5℃/min的速度升至270℃，空氣流量45mL/min，氫氣流量55mL/min，分流比20：1，進(jìn)樣器溫度270℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)溶劑對(duì)重結(jié)晶的影響

使用甲醇、乙醇、丙酮為溶劑，在相同養(yǎng)晶時(shí)間和料液比及水浴回流溫度的條件下，對(duì)植物甾醇重結(jié)晶提純，得到三類(lèi)植物甾醇晶體。分析三種溶劑中的晶體形狀及得率，無(wú)水乙醇得率最高為63.98%，晶形呈白色針尖狀;丙酮次之得率為55.26%，晶形呈白色顆粒狀;甲醇得率最小僅為9.61%，因溶解度較小的緣故，其晶體呈絮狀，顏色淺黃。

2.2 單因素初步試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)重結(jié)晶的影響

料液比是植物甾醇質(zhì)量與溶劑體積的比值。當(dāng)料液比增加，溶液過(guò)飽和度較低，晶體形狀較好，有利于提高晶體純度，但結(jié)晶速度會(huì)變慢，得率較低;當(dāng)料液比降低，溶液過(guò)飽和度增大，擴(kuò)散阻力增加，導(dǎo)致晶體易包藏母液，使得結(jié)晶純度不高。

植物甾醇得率在三種溶劑中隨料液比的下降而出現(xiàn)先上升后下降的過(guò)程，并在料液比1：30時(shí)達(dá)到最大值。無(wú)水乙醇溶液中晶體得率最高為69.75%，而丙酮中的最大晶體得率為68.48%，甲醇溶液最大晶體得率僅為17.48%，這是因?yàn)橹参镧薮荚诩状贾腥芙舛茸钚?，結(jié)晶率不高。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇料液比為1：30。

2.2.2 結(jié)晶溫度對(duì)重結(jié)晶的影響

提高結(jié)晶溫度有利于晶體擴(kuò)散，在較高溫度下生長(zhǎng)的晶體，由于結(jié)晶質(zhì)點(diǎn)排斥外來(lái)雜質(zhì)的能力增強(qiáng)，晶體質(zhì)量好。但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致結(jié)晶母液的過(guò)飽和度下降，晶體不完全析出，得率下降。相反低溫時(shí)則晶體生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，雜質(zhì)析出多，晶體質(zhì)量受影響。

在三種溶劑中料液比和養(yǎng)晶時(shí)間相同條件下，不同結(jié)晶溫度對(duì)植物甾醇晶體影響。重結(jié)晶得率均隨結(jié)晶溫度的升高而降低，其中-10℃為最佳結(jié)晶溫度。

2.2.3 養(yǎng)晶時(shí)間對(duì)重結(jié)晶的影響

分別在2.0h，4.0h，6.0h，8.0h時(shí)，評(píng)價(jià)甾醇重結(jié)晶得率受養(yǎng)晶時(shí)間的影響。可發(fā)現(xiàn)養(yǎng)晶時(shí)間對(duì)晶體得率影響不大，在約4.0h后趨于平緩，最佳養(yǎng)晶時(shí)間為4.0h。

2.3 重結(jié)晶優(yōu)化工藝結(jié)果

2.3.1 植物甾醇重結(jié)晶響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的純化條件為：料液比1：30、結(jié)晶溫度-10℃、養(yǎng)晶時(shí)間4.0h。以乙醇為例，參照Design Expert軟件的分析結(jié)果對(duì)植物甾醇重結(jié)晶工藝進(jìn)行優(yōu)化。

使用方差分析進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸模型方程的有效性檢驗(yàn)，如表1?？砂l(fā)現(xiàn)，該模型F值為39.14，y（P>F）<0.0001。模型的顯著性與y值相關(guān)，當(dāng)y小于0.0500時(shí)表明模型影響是顯著的，當(dāng)y值小于0.0100時(shí)表明模型影響極顯著，因此A、B、AB、BC對(duì)整個(gè)試驗(yàn)的影響均為極顯著。

運(yùn)用Design Expert軟件進(jìn)行分析，得出最佳提純工藝：料液比1：32.6，養(yǎng)晶時(shí)間6.08h，結(jié)晶溫度-9.44℃，植物甾醇的重結(jié)晶得率為66.22%。

在具體操作中將應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化后的工藝參數(shù)調(diào)整為：料液比1：30，養(yǎng)晶時(shí)間6.0h，結(jié)晶溫度-10℃。在此參數(shù)條件下進(jìn)行3次乙醇重結(jié)晶試驗(yàn)，得率為67.26%±0.73%，試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程的預(yù)測(cè)值吻合良好。這表明該模型可優(yōu)化控制提純過(guò)程的工藝參數(shù)。

2.3.2 料液比與結(jié)晶溫度對(duì)重結(jié)晶得率的影響

依據(jù)回歸方程生成料液比與結(jié)晶溫度的響應(yīng)曲面分析，得到當(dāng)乙醇為溶劑時(shí)料液比與結(jié)晶溫度對(duì)重結(jié)晶得率。當(dāng)結(jié)晶溫度確定時(shí)，重結(jié)晶得率將隨料液比增大而先增加（51.08%～64.26%），再逐漸下降（64.26%～59.51%）;當(dāng)料液比確定時(shí)，得率隨結(jié)晶溫度升高而緩慢下降（51.08%～50.23%）。說(shuō)明料液比與結(jié)晶溫度有相互作用。

2.3.3 料液比與養(yǎng)晶時(shí)間對(duì)重結(jié)晶得率的影響

根據(jù)回歸方程生成料液比和養(yǎng)晶時(shí)間的響應(yīng)曲面分析，得到當(dāng)乙醇為溶劑時(shí)料液比與結(jié)晶溫度對(duì)重結(jié)晶得率。當(dāng)養(yǎng)晶時(shí)間確定時(shí)，重結(jié)晶得率隨料液比增加而先逐漸增大（48.75%～63.45%），再緩慢下降（63.45%～54.03%）;當(dāng)料液比確定時(shí)，得率隨養(yǎng)晶時(shí)間的變化趨勢(shì)較為平緩（48.75%～51.88%），即養(yǎng)晶時(shí)間對(duì)得率影響小。說(shuō)明料液比和結(jié)晶溫度有相互作用。

2.3.4 結(jié)晶溫度和養(yǎng)晶時(shí)間對(duì)重結(jié)晶得率的影響

根據(jù)回歸方程生成結(jié)晶溫度和養(yǎng)晶時(shí)間的響應(yīng)曲面分析，得到當(dāng)丙酮為溶劑時(shí)料液比與結(jié)晶溫度對(duì)重結(jié)晶得率。當(dāng)結(jié)晶溫度確定時(shí)，植物甾醇的重結(jié)晶得率隨養(yǎng)晶時(shí)間的增加先增大后下降（58.43%～64.74%，64.74%～62.85%）;當(dāng)養(yǎng)晶時(shí)間確定時(shí)，得率隨結(jié)晶溫度增加而逐漸降低（58.43%～57.08%）。說(shuō)明料液比與結(jié)晶溫度有相互作用。

2.4 氣相色譜結(jié)果

采用標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間定性法，以膽甾醇為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)氣相色譜檢測(cè)混合植物甾醇樣品的出峰順序，依次為膽甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇。見(jiàn)圖1至3。

通過(guò)面積歸一法計(jì)算植物甾醇中各單體含量。以甲醇溶劑對(duì)植物甾醇提純時(shí)，菜籽甾醇含量最低，為1.87%，β-谷甾醇的含量最高，為35.66%，總甾醇含量為73.06%。以乙醇溶劑對(duì)植物甾醇提純時(shí)，四種單體含量從大到小依次為β-谷甾醇>豆甾醇>菜油甾醇>菜籽甾醇，同時(shí)總甾醇含量為87.76%。以丙酮為溶劑對(duì)植物甾醇提純時(shí)，豆甾醇和β-谷甾醇含量分別為30.02%和38.01%，較接近，同時(shí)總甾醇含量為84.91%。

基于氣相色譜分析結(jié)果，對(duì)甲醇、乙醇和丙酮三種溶劑對(duì)植物甾醇的提純效果進(jìn)行對(duì)比。植物甾醇在甲醇中溶解度小，得率在三種溶劑中最低，不建議用甲醇進(jìn)行提純;當(dāng)以乙醇為提純?nèi)軇r(shí)，各單體含量較均勻，β-谷甾醇含量最多;用丙酮提純后的植物甾醇純度也比較高，但會(huì)有豆甾醇富集，使得各甾醇單體比例發(fā)生變化，如果要使提純后產(chǎn)品與原料中甾醇組成比例相近，最好不用丙酮為重結(jié)晶溶劑。

比較植物甾醇晶體形狀發(fā)現(xiàn)，晶形粘稠度、聚合度與豆甾醇含量相關(guān)，形狀差異與β-谷甾醇的含量有關(guān)。用甲醇提純后，晶體呈粘稠狀結(jié)塊，晶形不明顯，因?yàn)榧状继峒兊摩?谷甾醇最少。用丙酮提純后，晶體粘稠度低、聚合度高，晶形完整，因?yàn)楸峒兊摩?谷甾醇含量較低。使用乙醇提純后的晶體呈透明細(xì)長(zhǎng)針形，因?yàn)槠渲笑?谷甾醇含量較高。

3 結(jié)語(yǔ)

（1）使用溶劑提純得率的高低依次是乙醇，丙酮，甲醇。以乙醇為溶劑，最佳提純工藝為：料液比1：32.6，結(jié)晶溫度-9.44℃，養(yǎng)晶時(shí)間6.08h，重結(jié)晶得率為66.22%;通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)設(shè)計(jì)法分析，植物甾醇和乙醇的料液比（A）、結(jié)晶溫度（B）及養(yǎng)晶時(shí)間（C）對(duì)響應(yīng)值的多元二次響應(yīng)面回歸模型方程為：Y=64.94+2.17A-1.98B+0.49C-9.71 A2-0.86B2-3.42C2-0.17AB-0.72AC+0.27BC。（2）氣相色譜分析，植物甾醇出峰時(shí)間的先后順序依次為菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇。乙醇溶劑的提純效果最好，四種甾醇單體含量為菜籽甾醇3.29%、菜油甾醇17.03%、豆甾醇23.59%、β-谷甾醇43.88%，總甾醇含量為87.77%。

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