植物提取物對(duì)薏苡黑粉病菌的抑制作用

莫熙禮，魏秀竹，武華文，江厚成

（黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州興義 562400）

薏苡黑粉病菌屬于擔(dān)子菌亞門(mén)黑粉菌屬的真菌，能引起薏苡黑粉病。薏苡黑粉病是黔西南州薏苡主要病害之一，對(duì)薏苡的生產(chǎn)造成很大威脅，成為制約黔西南州薏苡生產(chǎn)的重要因素。目前對(duì)該病的防治主要是使用化學(xué)藥劑，化學(xué)藥劑的使用導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生、毒性殘留以及環(huán)境污染等種種弊端的出現(xiàn)[1]，嚴(yán)重危及到人類(lèi)健康、生態(tài)平衡以及社會(huì)發(fā)展。植物源殺菌劑越來(lái)越受到人們的重視，且具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。近年來(lái)，植物提取物對(duì)病原物抑制作用方面的研究報(bào)道較多，但在藥用植物病害上的研究報(bào)道甚少。為此，筆者通過(guò)離體試驗(yàn)，初步測(cè)試了20種植物提取物對(duì)黑粉病的抑制作用，篩選出3種抑菌效果較好的植物提取物，并測(cè)定其防治該病的最佳濃度，旨在為研制和開(kāi)發(fā)防治薏苡黑粉病新型植物源農(nóng)藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病原菌。薏苡黑粉病菌采集于黔西南州農(nóng)作物科學(xué)研究所薏苡示范基地。在薏苡果實(shí)上分離得到病瘤，風(fēng)干后存放于紙盒內(nèi)，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前將病瘤碾碎并過(guò)40目篩，得到菌粉。

1.1.2 供試植物。大蒜、花椒、魚(yú)腥草、薄荷購(gòu)于菜市場(chǎng)，麻黃、澤瀉、馬錢(qián)、板藍(lán)根、八角茴香、當(dāng)歸、黃芩、藿香、穿心蓮購(gòu)于中藥店，夾竹桃、蒲公英、大青葉、射干、菊花采集于興義市頂效。將陰干的植物材料放至恒溫烘箱內(nèi)加溫至50℃烘干，粉碎后過(guò)40目篩（0.35 mm）置于密封袋中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備。植物材料的提取采用CEP提取法[2]，稱取樣品干粉20 g放于三角瓶?jī)?nèi)，加入200 mL 95%乙醇，在室溫下于搖床上振蕩提取過(guò)濾，將提取液在經(jīng)50℃減壓濃縮，真空干燥至恒重，計(jì)算提取率，密封置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 植物提取液對(duì)黑粉病菌冬孢子萌發(fā)的影響。采用玻片萌發(fā)法，測(cè)定植物提取液對(duì)黑粉病冬孢子萌發(fā)的影響。用濃度為50%乙醇將上述植物提取物充分溶解，制成5 mg/mL的母液。將提取液移入培養(yǎng)基中，配成濃度為0.50和0.25 mg/mL，然后將其倒在載玻片上，把濃度為104個(gè)/mL孢子懸浮液涂在載玻片上，于25℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)24 h后顯微鏡觀察，測(cè)定孢子萌發(fā)率。以上處理，每種植物提取物的每個(gè)濃度3次重復(fù)。

1.2.3 植物提取液對(duì)黑粉病菌擔(dān)孢子生長(zhǎng)的影響。采用玻片萌發(fā)法，觀察植物提取液對(duì)黑粉病菌擔(dān)孢子和次生擔(dān)孢子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響。將配制好含有一定濃度（0.50和0.25 mg/mL）提取液的培養(yǎng)基，倒在載玻片上，把濃度為104個(gè)/mL孢子懸浮液涂在載玻片上，以加相應(yīng)量乙醇的培養(yǎng)基為對(duì)照。于25℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)48 h后顯微鏡觀察，測(cè)定植物提取液對(duì)病原菌擔(dān)孢子的生長(zhǎng)抑制率。以上處理，每種植物提取物的每個(gè)濃度3次重復(fù)。

1.2.4 3種植物提取液對(duì)黑粉病菌最佳抑制濃度的測(cè)定。根據(jù)以上試驗(yàn)得到花椒、射干、蒲公英對(duì)黑粉病菌抑制作用最好（表1～2）。配制花椒濃度為0.500、0.250、0.125、0.065 mg/mL，射干提取液濃度為0.500、0.250、0.125、0.065 mg/mL，蒲公英提取液濃度為 2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL。

冬孢子萌發(fā)率的測(cè)定：用濃度為50%乙醇將花椒、射干、蒲公英提取物充分溶解，制成5 mg/mL的母液。將提取液移入培養(yǎng)基中，配成上述濃度，然后將其倒在載玻片上，把濃度為104個(gè)/mL孢子懸浮液涂在載玻片上，于25℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)24 h后顯微鏡觀察，測(cè)定孢子萌發(fā)率。

擔(dān)孢子抑制率的測(cè)定：將配制好含有一定濃度植物提取液的培養(yǎng)基，倒在載玻片上，把濃度為104個(gè)/mL孢子懸浮液涂在載玻片上，以加相應(yīng)量乙醇的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。于25℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)48 h后顯微鏡觀察，測(cè)定植物提取液對(duì)病原菌擔(dān)孢子的生長(zhǎng)抑制率。以上處理，每種植物提取物的每個(gè)濃度3次重復(fù)。

抑制率（%）=（對(duì)照病菌擔(dān)孢子生長(zhǎng)長(zhǎng)度-加提

1.2.5 3種植物提取液對(duì)黑粉病菌生長(zhǎng)的影響。將植物提取物加入培養(yǎng)基中，配成一定濃度，然后再將黑粉病菌菌落菌餅接種到PDA培養(yǎng)基平板上，在25℃的培養(yǎng)箱中保濕暗培養(yǎng)，10 d后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物的提取率

從表1可以看出，不同植物乙醇提取物的提取率不同，澤瀉、馬錢(qián)、夾竹桃、八角茴香、菊花及射干的提取率較高，提取率分別為31.21%、32.17%、30.32%、30.56%、33.21%和30.48%。大蒜和大青葉乙醇提取物的提取率較低，分別僅9.32%和8.35%。這可能與各植物所含的化合物成分不相同有關(guān)。

表1 供試植物提取率%

2.2 植物提取液對(duì)薏苡黑粉病菌冬孢子萌發(fā)的影響

由表2可以看出，不同植物的提取物對(duì)黑粉病菌冬孢子萌發(fā)的抑制效果不一樣，不同濃度的植物提取物，冬孢子的萌發(fā)率不同。在提取物濃度為0.50 mg/mL時(shí)，黑粉病菌冬孢子萌發(fā)率低于50%的植物有7種，分別為花椒、大蒜、大青葉、板藍(lán)根、黃芩、蒲公英和射干，萌發(fā)率分別為46.13%、42.21%、49.56%、48.41%、41.49%、43.44%和40.42%。在提取物濃度為0.25 mg/mL時(shí)，花椒、大蒜、蒲公英和射干提取物對(duì)冬孢子萌發(fā)率仍然低于50%，分別為47.18%、44.87%、41.43%和46.43%。

2.3 植物提取液對(duì)薏苡黑粉病菌擔(dān)孢子生長(zhǎng)的抑制作用

由表3可知，除了菊花提取物外，其他19種植物提取物對(duì)黑粉病病菌擔(dān)孢子的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定程度的抑制效果。其中花椒、蒲公英和射干提取物對(duì)擔(dān)孢子的抑制率較高，在提取物濃度為0.50 mg/mL時(shí)，抑制率分別為69.62%、68.14%和72.42%，當(dāng)提取物濃度為0.50 mg/mL時(shí)，其抑制率分別為73.78%、64.75%、75.00%和75.16%。根據(jù)表3和表4的結(jié)果，選用花椒、蒲公英和射干提取物進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 3種植物提取液對(duì)黑粉病菌最佳抑制濃度的測(cè)定

由表4可知，不同濃度的植物提取物對(duì)黑粉病菌的抑制效果不同。隨著3種植物提取物濃度的升高，各提取物濃度處理冬孢子的萌發(fā)率差異不顯著，但對(duì)擔(dān)孢子的抑制效果差異顯著?；ń贰⑸涓珊推压⑻崛∥锏臐舛确謩e為0.125、0.125和1.000 mg/mL時(shí)，對(duì)擔(dān)孢子生長(zhǎng)抑制效果最好，抑制率分別為76.08%、77.11%和69.35%。從擔(dān)孢子的生長(zhǎng)情況來(lái)看，花椒和射干提取物處理后，病菌冬孢子生長(zhǎng)擔(dān)孢子和少量的擔(dān)子孢子，不生長(zhǎng)次生擔(dān)孢子，擔(dān)孢子存在畸形情況，且隨著提取物的濃度升高而嚴(yán)重。蒲公英提取物處理后，黑粉病菌冬孢子有擔(dān)孢子、擔(dān)子孢子生長(zhǎng)，但擔(dān)孢子存在畸形情況，節(jié)間膨大，擔(dān)孢子生長(zhǎng)受阻。

表2 植物提取物對(duì)黑粉病菌冬孢子萌發(fā)率的影響 %

表3 植物提取物對(duì)黑粉病菌擔(dān)孢子抑制作用 %

2.5 植物提取液對(duì)黑粉病菌生長(zhǎng)的影響

由表5可以看出，供試3種植物提取物在設(shè)置的不同濃度下對(duì)病原菌的生長(zhǎng)都有一定程度的抑制作用，不同植物提取物在相同濃度下對(duì)黑粉病菌生長(zhǎng)的抑制效果不一樣，同一種殺菌劑在不同濃度下對(duì)黑粉病菌生長(zhǎng)抑制效果也不一樣?；ń诽崛∥锔鳚舛忍幚韺?duì)黑粉病菌生長(zhǎng)的抑制效果較好，尤其在濃度為0.125 mg/mL時(shí)，其對(duì)黑粉病菌生長(zhǎng)的抑制效果最好，菌落直徑為8.3 mm，抑制率為67.06%。射干提取物在濃度為0.125和0.065 mg/mL時(shí)，對(duì)黑粉病菌生長(zhǎng)的抑制效果較好，菌落直徑分別為11.7、12.4 mm，抑制率分別為53.57%、50.79%。而蒲公英提取物各濃度處理對(duì)黑粉病菌生長(zhǎng)的抑制作用不顯著，抑制率都低于50%。

表4 3種植物提取液對(duì)黑粉病菌最佳抑制作用

表5 植物提取液對(duì)黑粉病菌生長(zhǎng)的影響

3 討論

在植物中尋找生物活性物質(zhì)或者直接開(kāi)發(fā)植物源農(nóng)藥是目前農(nóng)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。該試驗(yàn)采用玻片萌發(fā)法，測(cè)定20種植物源乙醇提取物對(duì)薏苡黑粉病菌的冬孢子萌發(fā)率和擔(dān)孢子生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，在提取物濃度為0.50和0.25 mg/mL的條件下，花椒、射干、蒲公英提取物處理的黑粉病菌冬孢子萌發(fā)率較低，且其對(duì)擔(dān)孢子生長(zhǎng)的抑制效果較好。由此可以推斷出花椒、射干和蒲公英植物體內(nèi)有強(qiáng)烈的抑菌活性成分，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。

該試驗(yàn)測(cè)定了花椒、射干、蒲公英提取物在不同濃度下對(duì)薏苡黑粉病菌的抑制效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)花椒、射干、蒲公英提取物各濃度處理后，病菌冬孢子的萌發(fā)率都低于50%，說(shuō)明這3種植物提取物對(duì)薏苡黑粉病菌的冬孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用。這與袁劍剛等[3-7]的研究結(jié)果相一致。馮曉元等[8]研究表明中草藥提取物在較低的濃度下對(duì)桃褐腐病菌有較強(qiáng)的抑制作用。該研究也證明了這一點(diǎn)，花椒和射干提取物濃度在0.125 mg/mL時(shí)，對(duì)黑粉病菌擔(dān)孢子生長(zhǎng)的抑制效果最好，抑制率分別為76.08%和77.11%。

黑粉病冬孢子萌發(fā)，產(chǎn)生擔(dān)孢子，擔(dān)孢子萌發(fā)形成侵入絲或形成次生擔(dān)孢子，次生擔(dān)孢子也能萌發(fā)形成侵入絲，侵入薏苡，從而導(dǎo)致薏苡黑粉病[9]?；ń泛蜕涓商崛∥锾幚砗?，病菌冬孢子生長(zhǎng)擔(dān)孢子和少量的擔(dān)子孢子，不生長(zhǎng)次生擔(dān)孢子，擔(dān)孢子存在畸形情況，且隨著提取物的濃度升高而嚴(yán)重。蒲公英提取物處理后，黑粉病菌冬孢子有擔(dān)孢子、擔(dān)子孢子生長(zhǎng)，但擔(dān)孢子存在畸形情況，節(jié)間膨大，擔(dān)孢子生長(zhǎng)受阻，說(shuō)明這3種植物提取物能有效降低黑粉病菌的田間致病力，從而達(dá)到降低薏苡黑粉病流行的可能性。這與石菁等[10-11]的研究結(jié)果相符。

該試驗(yàn)測(cè)定了植物提取物對(duì)薏苡黑粉病菌的抑菌活性，沒(méi)做田間抑菌試驗(yàn)，田間試驗(yàn)的防治效果與室內(nèi)抑菌試驗(yàn)效果是否一致，篩選出的抑菌活性強(qiáng)的提取物制成何種劑型更有利于植物吸收等，都有待于以后進(jìn)一步研究。