太赫茲波譜在冬蟲(chóng)夏草檢測(cè)中的應(yīng)用

李 辰，魏丞昊，王志琪，黃略略，楊少壯

1) 深圳市太赫茲科技創(chuàng)新研究院, 廣東深圳 518102；2)深圳大學(xué)計(jì)算機(jī)與軟件學(xué)院, 廣東深圳 518060；3)深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,廣東深圳518055

冬蟲(chóng)夏草為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草菌，是寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合體[1-2]．作為中國(guó)特有的名貴中藥材之一，多產(chǎn)于中國(guó)四川、青海及西藏等省區(qū)，其活性成分包括核苷、甾醇、糖醇、氨基酸、脂肪酸、維生素類、多胺及多糖等[3-7]．由于生長(zhǎng)環(huán)境特殊、生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、產(chǎn)量少以及不易采集等因素，相比其他蟲(chóng)草，冬蟲(chóng)夏草貨源緊缺，價(jià)格昂貴．市場(chǎng)上冬蟲(chóng)夏草混偽品現(xiàn)象嚴(yán)重，不法分子為謀取暴利，以次充好、以假充真，常見(jiàn)混淆品如亞香棒蟲(chóng)草、新疆蟲(chóng)草、地蠶、古尼蟲(chóng)草、涼山蟲(chóng)草及甘遂等[8-11]，嚴(yán)重?cái)_亂市場(chǎng)秩序和影響消費(fèi)者身體健康．

太赫茲波指頻率處于0.1～10.0 THz的電磁波，在食品、藥品、生物化學(xué)及農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值[12-16]，生物大分子以及一些中藥活性成分的振動(dòng)及轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)能量差與太赫茲頻段的能級(jí)匹配，通過(guò)分析太赫茲波譜，能夠反映樣品內(nèi)成分的細(xì)微差異[17-18]，如利用該技術(shù)在低溫環(huán)境下發(fā)現(xiàn)異黃酮和人參皂苷的太赫茲波段特征吸收峰[19]．近些年，太赫茲波譜已廣泛用于大黃、莪術(shù)及附子等中藥材的鑒別和分析，太赫茲波譜對(duì)中藥研究具有重要意義[19-21]．然而，尚未見(jiàn)應(yīng)用于名貴中藥冬蟲(chóng)夏草檢測(cè)鑒別的研究報(bào)道．本研究利用透射及反射式太赫茲波譜技術(shù)，對(duì)正品及偽品類冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行檢測(cè)和鑒別，旨在發(fā)掘太赫茲波段的鑒別依據(jù)，提供一種快速的偽冬蟲(chóng)夏草真鑒別方法．

1 材料與方法

1.1 樣品制備

冬蟲(chóng)夏草正品和偽品信息如表1所示，共4種不同來(lái)源的正品冬蟲(chóng)夏草(正品1—4)，其中，正品1為固體微粉狀態(tài)的冬蟲(chóng)夏草對(duì)照品(批號(hào)121201-201103)，其余正品均為完整冬蟲(chóng)夏草實(shí)物(圖1)，購(gòu)自品牌中藥廠家．共3種冬蟲(chóng)夏草偽品(偽品1—3)，分別是亞香棒蟲(chóng)草、古尼蟲(chóng)草及地蠶，均為完整蟲(chóng)草實(shí)物，購(gòu)自本地中藥房．

表1 冬蟲(chóng)夏草樣品來(lái)源及產(chǎn)地信息

圖1 冬蟲(chóng)夏草正品和偽品實(shí)物Fig.1 Cordyceps sinensis and counterfeits

THz透射式檢測(cè)樣品制備采用粉末壓片法，即完整冬蟲(chóng)夏草正品及偽品使用中藥粉碎機(jī)粉碎后，放置在50 ℃烘箱干燥4 h，冷卻后移至瑪瑙研缽中充分研細(xì)，過(guò)200目篩．將過(guò)篩后的粉末與高密度聚乙烯(high density polyethylene, HDPE， 上海冠步科技)粉末充分混合，分別配制成100%和50%的質(zhì)量濃度，稱取約250 mg混合粉末，于35 MPa壓強(qiáng)下制成厚度約2 mm、直徑13 mm的薄片．本實(shí)驗(yàn)選擇HDPE粉末作為樣品的稀釋劑與支撐劑，折射率穩(wěn)定在1.51，在THz波段幾乎無(wú)吸收[22]．

THz反射式檢測(cè)樣品制備采用樣品切片法，將冬蟲(chóng)夏草樣品用手術(shù)刀快速切制片狀，厚度約為3 mm，表面平整，放置于反射式樣品臺(tái)待測(cè)試．

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

采用TeraView公司生產(chǎn)的Terapulse 4000型太赫茲時(shí)域光譜儀(THz time domain spectroscopy, THz-TDS)，系統(tǒng)光譜范圍為0.06～4.00 THz，光譜信噪比大于65 dB，光譜分辨率為1.2 cm-1．系統(tǒng)光路如圖2，飛秒激光進(jìn)入系統(tǒng)后經(jīng)分光鏡分束，一束泵浦光投射至THz 輻射源激發(fā)THz 脈沖，一束探測(cè)光經(jīng)可控光學(xué)延遲線投射至THz 探測(cè)器．激發(fā)的THz 脈沖由離軸拋物面鏡準(zhǔn)直聚焦于樣品表面，穿透或反射樣品的THz 脈沖由拋物面鏡聚焦到達(dá)THz 探測(cè)器上，實(shí)現(xiàn)樣品太赫茲信號(hào)的采集．根據(jù)THz波探測(cè)樣本的方式分為透射和反射兩種模式．這兩種檢測(cè)模式采用不同的光路模組，經(jīng)替換后可與相同的THz-TDS主體光路系統(tǒng)耦合并使用．

圖2 太赫茲波譜成像系統(tǒng)示意圖Fig.2 Schematic diagram of THz spectroscopy and reflective imaging system

1.3 研究方法

1.3.1 THz 透射式測(cè)量實(shí)驗(yàn)

將壓片樣品放入測(cè)試夾具中，固定于系統(tǒng)樣品倉(cāng)透射光路的聚焦處，密封樣品倉(cāng)腔體，獲取實(shí)測(cè)部位的THz透射時(shí)域信號(hào)．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在密封腔體內(nèi)持續(xù)充入氮?dú)?，使相?duì)濕度小于5%，溫度保持在約298 K．對(duì)同一樣品均從3個(gè)不同位置測(cè)量并取平均，從而獲取可靠的樣品THz時(shí)域信號(hào)．

使用THz-TDS直接采集參考和樣品的THz時(shí)域信號(hào)，其中，通過(guò)氮?dú)?無(wú)樣品放置)時(shí)獲得的參考信號(hào)為Eref(t)， 通過(guò)厚度為d的壓片樣品獲得的樣品信號(hào)為Esam(t)， 經(jīng)傅里葉變換后得到樣品和參考頻譜信號(hào)Esam(ω)和Eref(ω)， 則樣品光譜響應(yīng)函數(shù)為

(1)

其中，A(ω)為樣品與參考信號(hào)的振幅比；φ(ω)為樣品與參考信號(hào)的相位差；c為光速．依據(jù)Dorney等[23-25]提出的提取材料光學(xué)參數(shù)模型，可獲得樣品折射率n(ω)和吸收系數(shù)a(ω)分別為

(2)

(3)

可見(jiàn)，樣品在THz波段的特征吸收峰、吸光度譜線趨勢(shì)及平均折射率(及標(biāo)準(zhǔn)差)等波譜信息中反映了樣品的本征信息，可為成分鑒別提供參考．

1.3.2 THz 反射式成像測(cè)量實(shí)驗(yàn)

開(kāi)展基于THz-TDS的反射成像測(cè)量，將切片樣品固定于樣品臺(tái)薄片上及反射光路焦點(diǎn)處，并對(duì)樣品實(shí)施二維移動(dòng)平臺(tái)掃描，其中，橫向測(cè)量區(qū)域?yàn)?0 mm×10 mm，掃描步長(zhǎng)均為0.1 mm，測(cè)量過(guò)程中保證切片樣品均在實(shí)測(cè)成像區(qū)域內(nèi)．通過(guò)對(duì)1951 USAF分辨率測(cè)試靶(R3L3S1P，Thorlabs)進(jìn)行成像，測(cè)得該掃描設(shè)置下的橫向分辨率為0.3 mm．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需向反射光路持續(xù)充入氮?dú)?，以減少測(cè)量誤差．

采集完成后，重建THz時(shí)域數(shù)據(jù)能夠呈現(xiàn)樣品的THz切片圖像，圖像每個(gè)像素值代表該像素對(duì)應(yīng)THz時(shí)域信號(hào)在同一延遲時(shí)間的幅值大小．使用Image J(1.51j8版)軟件分析切片圖像的信號(hào)強(qiáng)度分布，分析真?zhèn)味x(chóng)夏草樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)區(qū)別．

2 結(jié)果與分析

2.1 真?zhèn)味x(chóng)夏草的THz透射式圖譜測(cè)定

圖3為50%和100%質(zhì)量濃度冬蟲(chóng)夏草對(duì)照品壓片的太赫茲圖譜．其中，圖3(a)為兩種質(zhì)量濃度對(duì)照品與參考(氮?dú)?的THz時(shí)域信號(hào)對(duì)比圖．相比于參考信號(hào)，100%純對(duì)照品透射信號(hào)峰峰強(qiáng)度衰減至參考信號(hào)的30%，相位時(shí)間延遲約3.9 ps，可由此估算樣品折射率為1.6；而50%對(duì)照品隨著樣品質(zhì)量濃度降低，壓片內(nèi)稀釋劑含量增多，壓片折射率小幅度下降，相位延遲略微變?。?/p>

圖3 冬蟲(chóng)夏草對(duì)照品的太赫茲圖譜Fig.3 THz time-domain signals, absorption coefficient and refractive index spectra of Cordyceps sinensis

圖3(b)和圖3(c)分別為不同質(zhì)量濃度對(duì)照品壓片在THz波段的吸收系數(shù)和色散曲線．圖3(b)和圖3(c)中插圖分別為100%對(duì)照品壓片于3個(gè)不同位置局部放大的吸收系數(shù)和色散曲線，可得1.01 THz處吸收系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差為0.10 cm-1，0.7 THz處折射率標(biāo)準(zhǔn)差為0.001．此外，冬蟲(chóng)夏草對(duì)照品在THz波段具有1.01 THz和1.13 THz(圖中虛線)的2個(gè)特征吸收峰，隨樣品質(zhì)量濃度增大，吸收峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明吸收峰與對(duì)照品內(nèi)某種成分的存在相關(guān)．另一方面，冬蟲(chóng)夏草對(duì)照品的折射率在0.50～1.50 THz內(nèi)呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢(shì)，且隨質(zhì)量濃度的增大，冬蟲(chóng)夏草折射率逐漸增強(qiáng)．不同質(zhì)量濃度對(duì)照品壓片在該波段的平均折射率分別為1.59±0.02(質(zhì)量濃度為100%，0.02為該頻段折射率值的標(biāo)準(zhǔn)差)和1.50±0.01(質(zhì)量濃度為50%)．

為探尋冬蟲(chóng)夏草對(duì)照品的兩個(gè)特征吸收峰，以及折射率特點(diǎn)是否適用于市面所售正品完整冬蟲(chóng)夏草，對(duì)同仁堂、義和祥及貫康品牌的冬蟲(chóng)夏草實(shí)施THz波譜檢測(cè)．圖4(a)為4種冬蟲(chóng)夏草正品的THz吸收系數(shù)曲線，可見(jiàn)，幾種正品與冬蟲(chóng)夏草對(duì)照品吸光度譜線的一致性較好，且存在1.01 THz和1.13 THz特征吸收峰，說(shuō)明這是所有冬蟲(chóng)夏草正品的共性特點(diǎn)，代表冬蟲(chóng)夏草中某些成分在THz頻段的響應(yīng)，也有可能是核苷、氨基酸、脂肪酸或多糖等代謝物共同作用的結(jié)果．圖4(b)為4種正品冬蟲(chóng)夏草在THz頻段的折射率譜，在0.5～1.50 THz波段，4種正品的平均折射率在1.59±0.04范圍內(nèi)，與對(duì)照品平均折射率結(jié)果接近．

另外，對(duì)比4種正品冬蟲(chóng)夏草的吸光度和折射率譜線發(fā)現(xiàn)，同仁堂冬蟲(chóng)夏草正品在整個(gè)THz頻段的吸光度較其余三者更強(qiáng)，且隨頻率增大，同仁堂正品折射率譜線的下降趨勢(shì)較其余三者快．初步推測(cè)可能與其冬蟲(chóng)夏草的采收產(chǎn)地不同有關(guān)，這可能成為今后鑒別冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)地及道地性的重要依據(jù)．

圖4 冬蟲(chóng)夏草正品的太赫茲圖譜Fig.4 Absorption coefficient and refractive index spectra of four authentic Cordyceps

圖5為對(duì)比幾種常見(jiàn)冬蟲(chóng)夏草偽品與正品的太赫茲圖譜．3種偽品均屬蟲(chóng)草類．其中，在圖5(a)和圖5(b)的THz吸光度和折射率譜線中，偽品地蠶在0.1～2.0 THz并無(wú)冬蟲(chóng)夏草正品所含的特征吸收峰，且折射率與正品有較大的差距(Δn>12%)， 可能與地蠶的來(lái)源、科目和成分與冬蟲(chóng)夏草正品有較大區(qū)別所致，因此，可以通過(guò)冬蟲(chóng)夏草正品的特征吸收峰和折射率快速排除偽品地蠶的摻假．

圖5 冬蟲(chóng)夏草正品和偽品的太赫茲圖譜對(duì)比Fig.5 Absorption coefficient and refractive index spectra of counterfeit Cordyceps compared with results of authentic ones

另一方面，亞香棒蟲(chóng)草和古尼蟲(chóng)草的特征吸收峰與正品冬蟲(chóng)夏草的特征吸收峰位非常接近，僅有0.01的峰位差別，而吸收峰強(qiáng)度稍弱，無(wú)法直接利用特征吸收峰區(qū)別這兩種偽品；在圖5(b)所示的折射率圖譜中，兩種偽品在0.50～1.50 THz內(nèi)，冬蟲(chóng)夏草的平均折射率在1.67±0.02，顯著大于4種正品折射率．表2列舉圖5(b)中4種正品和3種偽品的平均折射率及標(biāo)準(zhǔn)差，相同頻率下亞香棒蟲(chóng)草和古尼蟲(chóng)草的折射率與正品差異大于3%，反映了THz波譜在冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)螜z測(cè)研究方面的技術(shù)可行性，在今后鑒別其他蟲(chóng)草類冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)窝芯恐芯哂幸欢▍⒖純r(jià)值．

表2 冬蟲(chóng)夏草正品和偽品的折射率信息

2.2 真?zhèn)味x(chóng)夏草的THz反射式成像測(cè)定

圖6為冬蟲(chóng)夏草正品及偽品的THz時(shí)域切片圖像，能夠呈現(xiàn)切片樣品的輪廓和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)．各切片圖像的時(shí)間延遲分別標(biāo)注在各圖像注解內(nèi)；以地蠶(圖6(f)，圖示空心圈為A點(diǎn)位置，實(shí)心塊為B點(diǎn)位置)為例，圖7中列舉了兩點(diǎn)的THz時(shí)域信號(hào)和B-scan圖像，其中，時(shí)域信號(hào)中包含重合的薄片前表面和后表面，以及表面位置差異較大的蟲(chóng)草表面，這是由于蟲(chóng)草表面本身不平整所造成．

圖6 冬蟲(chóng)夏草正偽品在對(duì)應(yīng)延遲時(shí)間的THz切片圖像Fig.6 THz time-domain slice images of authentic Cordyceps and counterfeits at corresponding optical time delays

圖7 地蠶切片圖像中圖6(f)標(biāo)注的A點(diǎn)和B點(diǎn) 所對(duì)應(yīng)THz時(shí)域信號(hào)和B-scan圖像Fig.7 THz time-domain signals and B-scan images of point A and B noted inFig.6(f) of slice images of stachys geobombycis

為定量評(píng)估各正品和偽品結(jié)構(gòu)輪廓特點(diǎn)，選取各樣品切片圖像內(nèi)的輪廓面積，通過(guò)Image J軟件計(jì)算各樣品輪廓面積內(nèi)的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度分布，如表3．可見(jiàn)，正品類3種冬蟲(chóng)夏草相對(duì)平均信號(hào)強(qiáng)度均小于50，而偽品類的相對(duì)平均信號(hào)強(qiáng)度均大于65，表明正偽品切片在成分和結(jié)構(gòu)分布上具有一定區(qū)別，從而導(dǎo)致樣品THz反射時(shí)域信號(hào)強(qiáng)度的差異，進(jìn)一步從成像角度說(shuō)明THz波譜技術(shù)在蟲(chóng)草鑒別研究的技術(shù)可行性．

表3 冬蟲(chóng)夏草正品及偽品切片圖像相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度分布

結(jié) 語(yǔ)

利用THz波譜和成像技術(shù)對(duì)4種正品冬蟲(chóng)夏草和3種偽品冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行鑒別研究，發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草正品存在1.01 THz和1.13 THz特征吸收峰．通過(guò)分析幾種正品和偽品在THz波段的特征吸收峰位、折射率及切片成像等特征，評(píng)估正品和偽品之間的THz波譜共性特點(diǎn)和典型差異，為名貴中藥冬蟲(chóng)夏草的真?zhèn)舞b別提供一定技術(shù)參考．

本研究?jī)H對(duì)部分冬蟲(chóng)夏草樣品和3種常見(jiàn)偽品提供鑒別分析，并未覆蓋所有常見(jiàn)冬蟲(chóng)夏草偽品，如新疆蟲(chóng)草和涼山蟲(chóng)草等，后續(xù)研究將繼續(xù)收集更多樣本進(jìn)行測(cè)試分析，建立模型，進(jìn)一步挖掘波譜和圖像特點(diǎn)．此外，冬蟲(chóng)夏草及某些偽品在THz頻段的特征吸收峰還需確定吸收峰的歸屬類物質(zhì)，開(kāi)展進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證工作．THz波譜和成像數(shù)據(jù)能夠反映冬蟲(chóng)夏草的一部分本征信息，可為今后該技術(shù)應(yīng)用于冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)地、道地性及品種品質(zhì)甄別研究提供了一定的技術(shù)支持．