AU5800型全自動(dòng)生化儀對(duì)脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2活性的檢測(cè)性能研究*

吳美玲 劉 斌 高 華 張炳昌 欒 芳*

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(1ipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)是磷脂酶超家族中的亞型之一，又稱(chēng)為血小板活化因子乙酰水解酶，由血管內(nèi)膜中的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞合成和分泌，血小板活化因子可促進(jìn)其分泌。Lp-PLA2與脂蛋白顆粒結(jié)合的形式存在，與低密度脂蛋白結(jié)合的約占80%，其余與高密度脂蛋白和極低密度脂蛋白相結(jié)合；Lp-PLA2可水解氧化低密度脂蛋白中的氧化磷脂，生成溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸脂類(lèi)等促炎物質(zhì)[1-3]。在動(dòng)脈粥樣硬化患者中，Lp-PLA2水平與低密度脂蛋白膽固醇(low density 1ipoprotein cholesterol，LDL-C)亞組分水平[4-5]呈正相關(guān)，是血管特異性的炎癥及與斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)的新炎癥標(biāo)志物，是冠心病和腦卒中及其他動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的臨床預(yù)測(cè)指標(biāo)[6-10]。

目前，Lp-PLA2檢測(cè)多采用酶聯(lián)免疫或化學(xué)發(fā)光的方法檢測(cè)其質(zhì)量，對(duì)Lp-PLA2活性檢測(cè)的報(bào)道少見(jiàn)。AU5800型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Lp-PLA2活性的優(yōu)勢(shì)是可以與其他血脂指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)，方便臨床解讀化驗(yàn)結(jié)果。為此，本研究對(duì)AU5800型全自動(dòng)生化儀檢測(cè)Lp-PLA2活性的正確度、精密度、線性范圍、可報(bào)告范圍、參考區(qū)間和靈敏度進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取2017年7月在健康體檢中心體檢的20名健康體檢者，其中男性9名，女性11名；年齡18歲～59歲，平均年齡(33.55±12.10)歲；排除高血壓、高血脂、糖尿病、甲狀腺功能異常等疾病。清晨無(wú)劇烈運(yùn)動(dòng)，空腹采集靜脈血標(biāo)本3 ml，離心后取血清于2 h內(nèi)在AU5800型全自動(dòng)生化儀上檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑

BECKMAN AU5800型全自動(dòng)生化儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)，Lp-PLA2活性試劑盒(批號(hào)Z170501)及配套校準(zhǔn)品(重慶中元生物技術(shù)有限公司 批號(hào)Z170501)，原裝質(zhì)控品(低值批號(hào)170501、高值批號(hào)170502)，速率法檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 正確度驗(yàn)證

依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“臨床檢驗(yàn)定量測(cè)定項(xiàng)目精密度與正確度性能驗(yàn)證”(WS/T492-2016)文件[11]要求，檢測(cè)Lp-PLA2活性試劑盒配套校準(zhǔn)品(校準(zhǔn)品可溯源至DRE-XA15590400ME)15次，計(jì)算15次連續(xù)測(cè)定結(jié)果的均值。測(cè)定值與理論值相比較，與說(shuō)明書(shū)參考值相對(duì)偏差≤10%作對(duì)照。

1.3.2 精密度驗(yàn)證

(1)批內(nèi)精密度。依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T420-2013)和臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)EP5-A2文件[12-13]“定量測(cè)量方法的精密度性能評(píng)價(jià)”要求，取Lp-PLA2活性試劑盒配套低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品各1份，連續(xù)檢測(cè)20次，計(jì)算均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)及變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)。

(2)批間精密度。依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T420-2013)和CLSI EP5-A2文件[12-13]要求，取Lp-PLA2活性試劑盒配套低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品各1份，連續(xù)檢測(cè)20 d，計(jì)算M±SD及CV。

實(shí)驗(yàn)室自定義總允許誤差(total error allowance，TEa)為20%，批內(nèi)精密度目標(biāo)按1/4TEa計(jì)算即批內(nèi)CV≤5%為符合要求，批間精密度目標(biāo)按1/3 TEa即批間CV≤6.6%為符合要求。

1.3.3 線性范圍驗(yàn)證

依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T420-2013)和CLSIEP6-A文件[12-14]要求，選取接近線性范圍上限的高濃度血清標(biāo)本(H)、低濃度血清標(biāo)本(L)各一份，按高低比例H、6∶2、4∶4、3∶5及L混勻，測(cè)定每份標(biāo)本分析物濃度3次取平均值作為實(shí)測(cè)值，以實(shí)測(cè)值為Y、理論值為X擬合一次線性回歸方程，評(píng)估Lp-PLA2在10.0～1500.00 IU/L范圍內(nèi)的檢測(cè)是否呈線性。結(jié)果判斷：曲線回歸系數(shù)r2≥0.990。

1.3.4 可報(bào)告范圍驗(yàn)證

選取濃度在接近線性范圍上限的高濃度血清標(biāo)本，按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64以及1∶128的比例稀釋?zhuān)總€(gè)濃度檢測(cè)3次，統(tǒng)計(jì)均值與理論值比較，以80%≤R≤120%定位可接受范圍。

1.3.5 參考區(qū)間驗(yàn)證

依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T402-2012)，從醫(yī)院健康體檢中心收集健康人血液標(biāo)本20份，與說(shuō)明書(shū)提供的參考范圍0～659 IU/L進(jìn)行驗(yàn)證，R≥90%符合要求。

1.3.6 靈敏度分析

Lp-PLA2連續(xù)測(cè)試6個(gè)樣本，查看各測(cè)吸光度變化量⊿A，通過(guò)⊿A=A2-A1，計(jì)算樣本濃度為檢測(cè)范圍內(nèi)時(shí)，分析靈敏度的變化。⊿A≥0.02 mA/min·L/IU，符合要求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。均數(shù)采用±s表示，理論值和實(shí)測(cè)值的線性關(guān)系分析通過(guò)擬合一次線性回歸方程。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正確度

可溯源至DRE-XA15590400ME的校準(zhǔn)品連續(xù)測(cè)定15次，計(jì)算均值為530.4 mg/l，理論值為515.0 mg/l，偏差2.99%，符合要求，見(jiàn)表1。

表1 AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性的準(zhǔn)確度

2.2 精密度

2.2.1 批內(nèi)精密度

試劑盒配套低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品分別連續(xù)檢測(cè)20次，變異系數(shù)CV分別為1.39%和2.67%，均＜5%，符合要求，見(jiàn)表2-1、表2-2。

2.2.2 批間精密度

每日測(cè)試試劑盒配套低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，連續(xù)檢測(cè)15 d，變異系數(shù)CV分別為3.47%和3.00%，均＜6.6%，均符合要求，見(jiàn)表3。

2.3 線性范圍

以Lp-PLA2活性理論值(不同稀釋度)為X軸，實(shí)測(cè)均值為Y軸，得出回歸方程為Y=0.9961X+7.213(r2=0.9997)，顯示線性良好，線性范圍在9.63～1580.87 IU/L內(nèi)，大于試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定的10～1500 IU/L，且符合要求，其線性檢測(cè)情況如圖1所示、見(jiàn)表4。

2.4 可報(bào)告范圍

通過(guò)驗(yàn)證，標(biāo)本按照不同比例稀釋后，最大稀釋64倍在80%≤R≤120%可接受范圍之內(nèi)，可報(bào)告范圍為9.63～101175.68 IU/L，見(jiàn)表5。

2.5 參考區(qū)間

隨機(jī)抽取20名健康者的血清進(jìn)行Lp-PLA2活性測(cè)定，驗(yàn)證廠家提供范圍0～659 IU/L，90%在范圍內(nèi)為合格。實(shí)際側(cè)得范圍397.0～711.1 IU/L，95%在廠商給定參考范圍之內(nèi)，符合要求，見(jiàn)表6。

表2-1 AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性的批內(nèi)精密度(1～12次)

表2-2 AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性的批內(nèi)精密度(13～20次)

表3 AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性的批間精密度

表4 AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性的線性范圍驗(yàn)證(IU/L)

表5 AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性的可報(bào)告范圍驗(yàn)證(IU/L)

表7 AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性的分析靈敏度驗(yàn)證

圖1 AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性范圍驗(yàn)證的線性圖

2.6 分析靈敏度

連續(xù)測(cè)試6個(gè)標(biāo)本進(jìn)行Lp-PLA2活性測(cè)定，實(shí)際檢測(cè)濃度在檢測(cè)范圍內(nèi)時(shí)，試劑吸光度平均變化⊿A=0.0869≥0.02，符合中元生物試劑說(shuō)明書(shū)要求，見(jiàn)表7。

3 討論

Lp-PLA2是心血管疾病中一種新的炎癥標(biāo)記物，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病、進(jìn)展和斑塊破裂中起關(guān)鍵作用，是近幾年來(lái)心血管領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。相對(duì)于C反應(yīng)蛋白、白介素等傳統(tǒng)的炎癥指標(biāo)，Lp-PLA2在心血管疾病的診治中具有特異性高的優(yōu)勢(shì)。本研究實(shí)驗(yàn)室在AU5800型全自動(dòng)生化儀引入Lp-PLA2活性檢測(cè)，與低密度脂蛋白膽固醇、同型半胱氨酸以及小而密低密度脂蛋白膽固醇等血脂指標(biāo)組合，方便臨床對(duì)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。

表6 AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性的參考區(qū)間驗(yàn)證

本研究依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T 420-2013、WS/T 492-2016、WS/T 402-2012)以及CLSI EP5和EP6文件的要求，評(píng)估了AU5800型全自動(dòng)生化儀檢測(cè)Lp-PLA2活性的性能。結(jié)果顯示，AU5800型全自動(dòng)生化儀檢測(cè)Lp-PLA2活性的正確度較高，偏差為2.99%；批內(nèi)不精密度和批間不精密度均在實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的精密度目標(biāo)之內(nèi)；檢測(cè)線性范圍為9.63～1580.87 IU/L，可報(bào)告范圍為9.63～101175.68 IU/L，滿足臨床檢測(cè)需要；正常人群參考區(qū)間驗(yàn)證和靈敏度驗(yàn)證均符合要求。

2018年4月，美國(guó)《臨床化學(xué)》雜志報(bào)道，傳統(tǒng)免疫法檢測(cè)Lp-PLA2質(zhì)量時(shí)，由于受Lp-PLA2與脂蛋白結(jié)合存在形式干擾，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低，使得Lp-PLA2質(zhì)量和活性檢測(cè)結(jié)果不一致；串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè)Lp-PLA2質(zhì)量時(shí)，可以把Lp-PLA2與脂蛋白完全解離，Lp-PLA2質(zhì)量和活性檢測(cè)結(jié)果一致[15]。但是，串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)Lp-PLA2標(biāo)本前處理復(fù)雜、成本高，因此AU5800型全自動(dòng)生化儀檢測(cè)Lp-PLA2活性更能滿足于臨床需求，LC-MS/MS檢測(cè)的Lp-PLA2活性與AU5800型全自動(dòng)生化儀檢測(cè)的Lp-PLA2活性結(jié)果是否一致，尚需進(jìn)一步研究。

AU5800型全自動(dòng)生化儀測(cè)定Lp-PLA2活性，具有快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床大批量標(biāo)本的檢測(cè)，適用于心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科等科室對(duì)心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。