半滑舌鰨多聚免疫球蛋白受體(pIgR) 基因的克隆和表達(dá)分析*

王雙艷 王 磊 陳張帆 崔忠凱 周 茜 陳松林①

(1.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

多聚免疫球蛋白受體pIgR(Polymeric immune- globulin receptor)是Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的一員，在動(dòng)物黏膜相關(guān)淋巴組織中結(jié)合并介導(dǎo)分泌型抗體跨過(guò)上皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，經(jīng)酶切后以復(fù)合物的形式分泌到黏膜表面，抑制病原微生物的粘附和入侵，在先天性免疫與獲得性免疫中均具有重要作用(Phaliponet al,2003; Kaetzel,2005)。哺乳動(dòng)物的pIgR蛋白包含5個(gè)免疫球蛋白功能域(Ig-like domains,ILD)，可以與二聚體IgA或者四聚體IgM結(jié)合，兩棲動(dòng)物和鳥類的pIgR蛋白包含4個(gè)ILD，分別與哺乳動(dòng)物的第1、3、4和5個(gè)ILD同源(Piskurichet al,1995; Wielandet al,2004)。

目前，在紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)(Hamuroet al,2007)、鯉魚(Cyprinus carpio)(Romboutet al,2008)、草魚(Ctenopharynodon idellus)(張毅,2016)、牙鲆(Paralichthy solivaceus)(Xuet al,2013)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)(Fenget al,2009)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Zhanget al,2010)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)(丁冰潔等,2013)、鯽魚(Carassius auratus)(Wanget al,2017)等硬骨魚類中均克隆得到了pIgR基因。結(jié)構(gòu)分析表明，硬骨魚pIgR蛋白僅有2個(gè)ILD，分別與哺乳動(dòng)物的ILD1和ILD5同源。因此，研究魚類pIgR對(duì)于了解生物進(jìn)化過(guò)程具有重要意義。魚類pIgR也具有和哺乳動(dòng)物pIgR類似的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，顯示了生物進(jìn)化的嚴(yán)謹(jǐn)性和保守性。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在硬骨魚中存在一種新型的免疫球蛋白IgT。對(duì)虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，pIgR僅能與腸道IgT結(jié)合，而不能與血液IgT結(jié)合(Zhanget al,2010)，提示硬骨魚pIgR的功能仍有很多未知之謎。

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，由于其肉質(zhì)鮮美滑嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、生長(zhǎng)快速等特點(diǎn)而深受人們喜愛(ài)。隨著養(yǎng)殖數(shù)量的增多，病害的威脅也日趨嚴(yán)重，尤其是細(xì)菌引起的潰爛癥、腸炎癥最為嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，半滑舌鰨是一種底棲魚類，腹部摩擦底面，特別容易受到損傷，在水環(huán)境中黏膜包被的皮膚、鰓、腸等是病原侵襲的主要部位，黏膜不僅僅是物理屏障，其局部黏膜的免疫應(yīng)答對(duì)病原體的抵御更加重要。因此，對(duì)半滑舌鰨抗病分子機(jī)制的研究將會(huì)對(duì)其病害防治提供重要的理論基礎(chǔ)。目前關(guān)于pIgR基因在半滑舌鰨的克隆及功能研究尚未見報(bào)道。

本研究對(duì)半滑舌鰨的pIgR基因進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA克隆并初步分析其結(jié)構(gòu)特征，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)(邢賀飛等,2016)檢測(cè)了該基因在半滑舌鰨不同組織中的表達(dá)模式和在哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的刺激下不同組織的表達(dá)特征，從而為探究pIgR在半滑舌鰨的免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制、開發(fā)抗病相關(guān)分子標(biāo)記提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

1.1.1 正常組織 本實(shí)驗(yàn)中所用的半滑舌鰨取自山東省海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)公司，18月齡健康的半滑舌鰨體重為(104.9±4.6) g，全長(zhǎng)為(25.8±1.3) cm，體寬為(6.8±0.2) cm。麻醉后，解剖分離肝、脾、腎、頭腎、鰓、腸、肌肉、心臟、皮膚等組織，將組織樣品迅速放入RNA保存液中，置于-20℃冰箱保存。

1.1.2 哈維氏弧菌感染及樣品采集 根據(jù)半滑舌鰨的感染實(shí)驗(yàn)(Weiet al,2017)，將10月齡健康的半滑舌鰨經(jīng)腹腔注射哈維氏弧菌感染，在感染后的12、24、48、72和96 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，并以感染前0 h作為對(duì)照，分別取3條半滑舌鰨。將活魚麻醉后迅速取肝、脾、腸、腎、鰓和皮膚等6個(gè)免疫組織，放入RNA保存液中，置于-20℃冰箱中保存。

1.2 RNA提取及cDNA的合成

使用Trizol法進(jìn)行半滑舌鰨總RNA的提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，并使用Gene Quant Pro RNA/DNA分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。RNA鑒定合格后，用cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。使用TaKaRa RACE試劑盒，根據(jù)其說(shuō)明書合成RACE-Ready-cDNA。

1.3 pIgR基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

1.3.1 中間片段的驗(yàn)證 首先根據(jù)半滑舌鰨全基因組測(cè)序結(jié)果(Chenet al,2014)，獲得pIgR基因的部分cDNA序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引 物(pIgR-F/pIgR-R)(表1)，分別以腸、腎和鰓為模板進(jìn)行體系為15 μl的普通PCR擴(kuò)增。體系為：Mix為7.5 μl，pIgR-F為0.6 μl，pIgR-R為0.6 μl，ddH2O為5.3 μl，模板cDNA為1 μl。程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，為35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。

表1 本研究所用到的引物 Tab.1 Primers used in this study

將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用膠回收試劑盒(康為世紀(jì))對(duì)所需的目的片段進(jìn)行收集、純化，連接到pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂板后經(jīng)37℃培養(yǎng)12～16 h，挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆送到北京睿博興科生物技術(shù)有限公司(青島區(qū))測(cè)序。

1.3.2 5′和3′ RACE克隆 根據(jù)驗(yàn)證得到的部分cDNA序列設(shè)計(jì)5′和3′端的RACE引物(pIgR-5′- GSP/pIgR-5′-NGSP和pIgR-3′-GSP/pIgR-3′-NGSP)。第一輪反應(yīng)體系10 μl，根據(jù)TaKaRaTaqTMHot Start Version說(shuō)明書介紹的體系比例加樣混合，進(jìn)行Touch down PCR程序反應(yīng)。

將第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍后作為第二輪普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系為50 μl，同上按比例加樣混合后，進(jìn)行第二輪普通PCR反應(yīng)。將得到的PCR產(chǎn)物根據(jù)中間片段驗(yàn)證的方法處理并測(cè)序。

1.4 生物學(xué)分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

使用生物學(xué)軟件DNAstar對(duì)克隆得到的pIgR全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其開放閱讀框(ORF)以 及氨基酸序列，并推導(dǎo)出蛋白的分子量和等電點(diǎn)；使用SignalP4.1對(duì)翻譯的氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽分析，利用TMpred預(yù)測(cè)氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)域。pIgR基因同源氨基酸序列的搜索在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)Blast完成并預(yù)測(cè)功能結(jié)構(gòu)域，通過(guò)MEGA 7.0軟件完成生物系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和氨基酸多序列比對(duì)。

1.5 pIgR基因的表達(dá)模式檢測(cè)

通過(guò)使用qRT-PCR檢測(cè)健康的半滑舌鰨不同組織中pIgR基因的表達(dá)量；經(jīng)哈維氏弧菌感染刺激后6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的肝、腎、脾、腸、鰓和皮膚的表達(dá)模式。根據(jù)得到的ORF序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物(pIgR-qRT-F/pIgR-qRT-R)， 再 以β-actin基因(β-actin-F/β-actin-R)(表 1)作為內(nèi)參基因，根據(jù)TaKaRa SYBR?Premix ExTaqTM說(shuō)明書的方法進(jìn)行pIgR基因的定量分析。根據(jù)測(cè)得的Ct值，利用2-ΔΔCt法計(jì)算pIgR基因相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，設(shè)定P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 半滑舌鰨pIgR基因序列特征

半滑舌鰨pIgR基因的cDNA全長(zhǎng)為1419 bp，其中，ORF為1020 bp，編碼339個(gè)氨基酸，5′ UTR為 109 bp，3′ UTR為290 bp，相對(duì)分子質(zhì)量為37472.76 D，理論等電點(diǎn)為6.870。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在1～19 aa之間存在1個(gè)信號(hào)肽序列，之后為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，分別由263、22和54個(gè)氨基酸組成。胞外區(qū)包括2個(gè)ILD功能結(jié)構(gòu)域分別在26～111 aa和135～224 aa位置(圖1)。

圖1 半滑舌鰨pIgR基因cDNA序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列 Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequences of C.semilaevis pIgR

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及氨基酸多序列比對(duì)

將半滑舌鰨pIgR的氨基酸序列通過(guò)蛋白序列比對(duì)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的其他物種：大菱鲆(S.maximus,AGN54539.1)、牙鲆(P.olivaceus,ADK91435.1)、紅鰭東方鲀(T.rubripes,NP_001266944.1)、大黃魚(Larimichthys crocea,XP_010733629.2)、青鳉(Oryzias latipes,XP_004079170.1)、虹鱒(O.mykiss,ADB81776.1)、鯉魚(C.carpio,ADB97624.1)、草魚(C.idellus,ALX37964.1)、斑馬魚(Danio rerio,NP_001289179.1)、非洲爪蟾(Xenopus laevis,ABK62772.1)、原雞(Gallus gallus,NP_001038109.1)、鼠(Mus musculus,NP_ 035212.2)、人(Homo sapiens,NP_002635.2)的pIgR蛋白序列進(jìn)行分析。多序列氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示，半滑舌鰨pIgR與其他硬骨魚類都只含有2個(gè)ILD區(qū)，分別對(duì)應(yīng)哺乳類的ILD1和ILD5，哺乳類及鳥類在ILD1中存在3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(Complementary determining region,CDR)，而硬骨魚類則沒(méi)有相似序列(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示魚類的pIgR聚為一支，其中，半滑舌鰨與大菱鲆和牙鲆聚 為一個(gè)分支，3種淡水魚(鯉魚、草魚和斑馬魚)聚為一個(gè)分支；兩棲類、鳥類和哺乳類聚為另一支(圖3)。

圖2 半滑舌鰨pIgR氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果 Fig.2 The multiple sequence alignment of the pIgR amino acid

圖3 半滑舌鰨pIgR與其他物種pIgR系統(tǒng)進(jìn)化分析 Fig.3 Phylogenetic analysis of C.semilaevis pIgR sequence with other pIgR sequences in fish,amphibians,birds,and mammals

2.3 半滑舌鰨pIgR基因的表達(dá)模式

2.3.1pIgR基因在各組織中的表達(dá) 健康組織表達(dá)結(jié)果顯示，pIgR基因在半滑舌鰨各個(gè)組織中均有表達(dá)，在鰓中表達(dá)量最高，其次是心臟、脾臟和皮膚，在肝臟、頭腎和腸中表達(dá)量較低，在肌肉中的表達(dá)量最低(圖4)。

圖4 半滑舌鰨pIgR基因在不同組織的表達(dá)分布 Fig.4 pIgR gene of C.semilaevis expression profile in different tissues

2.3.2 哈維氏弧菌感染后pIgR基因的表達(dá)量的變化

經(jīng)哈維氏弧菌感染后，半滑舌鰨內(nèi)臟和鰓組織中pIgR基因的表達(dá)模式發(fā)生變化。各組織中pIgR基因的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，其中，鰓和脾臟在48 h時(shí)出現(xiàn)峰值；腎臟、肝臟和腸在72 h時(shí)出現(xiàn)峰值；皮膚在96 h內(nèi)一直處于上升趨勢(shì)(圖5)。

3 討論

本研究通過(guò)PCR及RACE方法成功獲得半滑舌鰨pIgR基因cDNA全長(zhǎng)序列，豐富了對(duì)半滑舌鰨免疫相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)。與硬骨魚類pIgR基因的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，表明8種硬骨魚類都只含有2個(gè)ILD，分別與哺乳動(dòng)物的ILD1和ILD5同源。哺乳動(dòng)物pIgR與免疫球蛋白的結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明ILD1是受體結(jié)合的必要結(jié)構(gòu)(Kaetzelet al,2005)。雖然已有研究證明，硬骨魚pIgR能夠結(jié)合IgM和IgT(Fenget al,2009; Zhanget al,2010)，但結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。另外，研究證明，斑馬魚存在多種pIgR-like基因，在鯉魚腸道中也發(fā)現(xiàn)一種具有IgM結(jié)合活性的pIgR-like蛋白(Kortumet al,2014)，在半滑舌鰨中的研究有待繼續(xù)開展。

組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，pIgR基因在半滑舌鰨各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中，在鰓中表達(dá)最高，在心臟、脾臟和皮膚中表達(dá)稍高，在肌肉中表達(dá)最低，說(shuō)明pIgR特異地在黏膜免疫相關(guān)組織中表達(dá)。心臟組織樣品采集時(shí)充盈了血液，因此pIgR表達(dá)量較高。本研究結(jié)果與牙鲆(Xuet al,2013)、大菱鲆(丁冰潔等,2013)、斜帶石斑魚(Fenget al,2009)和紅鰭東方鲀(Hamuroet al,2007)等基本一致。已有研究證明，硬骨魚類pIgR基因?qū)?xì)菌和寄生蟲的感染均有快速的響應(yīng)模式。滅活鰻弧菌(Vibrio anguillarum)浸泡刺激后，大菱鲆免疫組織中pIgR的相對(duì)表達(dá)量在72 h內(nèi)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且黏膜相關(guān)淋巴組織中的峰值出現(xiàn)最早(丁冰潔等,2013)。白點(diǎn)蟲感染泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)的脾臟、腎臟、皮膚和鰓中pIgR的表達(dá)量均有顯著升高(Yuet al,2018)。本研究對(duì)哈維氏弧菌感染不同時(shí)間，半滑舌鰨免疫相關(guān)組織中pIgR基因的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行了檢測(cè)。在鰓和4種內(nèi)臟組織中pIgR基因均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，其中，鰓和脾臟pIgR的表達(dá)量在48 h時(shí)出現(xiàn)峰值；腎臟、肝臟和腸中pIgR的表達(dá)量在72 h時(shí)出現(xiàn)峰值。然而，在皮膚中的pIgR的表達(dá)量在96 h內(nèi)持續(xù)上升，證明皮膚一直處于應(yīng)答狀態(tài)，這可能是因?yàn)楦骨蛔⑸涞墓S氏弧菌經(jīng)血液循環(huán)及組織擴(kuò)散到 皮膚，導(dǎo)致皮膚潰爛。因此，皮膚中大量表達(dá)pIgR，發(fā)揮持久的免疫防御作用，提示pIgR在黏膜免疫防御中發(fā)揮重要作用。

圖5 哈維氏弧菌感染后半滑舌鰨pIgR在免疫組織中表達(dá)變化 Fig.5 The expression of C.semilaevis pIgR in immunologic tissues after V.harveyi infection

綜上所述，本研究對(duì)半滑舌鰨pIgR基因進(jìn)行了cDNA全長(zhǎng)克隆、進(jìn)化分析及表達(dá)模式的研究，尤其是對(duì)pIgR在黏膜免疫防御中的作用進(jìn)行了深入分析，為進(jìn)一步研究pIgR在免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。