無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)在低齡與高齡孕婦中的臨床應(yīng)用價(jià)值比較

王奕霞 彭海山 侯亞萍 郭芳芳 王東梅 李怡 歐陽(yáng)浩新 楊潔霞

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442)

自1997年盧煜明教授[1]發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中存在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡釋放的游離DNA，到2011年通過(guò)商品化試劑盒檢測(cè)外周血游離DNA來(lái)篩查胎兒染色體非整倍體疾病，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(noninvasive prenatal testing，NIPT)技術(shù)備受關(guān)注。直至今日，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。相比于傳統(tǒng)篩查方法，無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)是目前敏感性最高的篩查方法，已被國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)具有很高的靈敏度和特異度，可達(dá)99%[2, 3]。為了更好地規(guī)范無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)的使用，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)也出臺(tái)了《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》來(lái)指導(dǎo)該項(xiàng)技術(shù)的臨床應(yīng)用。規(guī)范中指出，高齡孕婦為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)的慎用人群。但有研究表明，NIPT技術(shù)在高齡孕婦中也有良好的檢測(cè)性能[4-6]。為了進(jìn)一步明確NIPT在不同年齡段孕婦中的檢測(cè)效能是否存在差異，高齡孕婦是否適用NIPT，我們回顧性總結(jié)分析了2017年本中心接受NIPT檢測(cè)孕婦的結(jié)果，探討無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)在不同年齡段孕婦人群中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1～12月期間至廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診的單胎孕婦，孕12周以上，近期未接受過(guò)異體輸血、細(xì)胞治療、移植手術(shù)等，所有孕婦均自愿接受NIPT檢測(cè)。共收集10 862例孕婦，年齡15～49歲，孕周12～35周，所有孕婦均告知了該項(xiàng)方法的適應(yīng)證、局限性及可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)過(guò)知情選擇并簽署了知情同意書(shū)，該項(xiàng)研究符合倫理標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 NIPT檢測(cè) 抽取2支靜脈血5 ml于EDTA抗凝采血管中，顛倒混勻。采集標(biāo)本后在4℃條件下，8h內(nèi)運(yùn)輸至廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心進(jìn)行血漿分離，分離后的血漿采用博奧晶芯測(cè)序試劑盒進(jìn)行DNA提取、構(gòu)建文庫(kù)、文庫(kù)定量等操作，將待測(cè)文庫(kù)混合后在Proton測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)比對(duì)、拼接等生物信息處理后，經(jīng)過(guò)分析外周血中不同染色體水平的差異情況，進(jìn)而識(shí)別胎兒染色體非整倍體異常，并得出胎兒患染色體非整倍體疾病的風(fēng)險(xiǎn)概率。結(jié)果分析采用基于二元假設(shè)的Z值判斷某條染色體是否有拷貝數(shù)異常，主要判斷標(biāo)準(zhǔn)為：若Z≥3或Z≤-3時(shí)，結(jié)果提示為非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)；若-3

1.3 核型分析 無(wú)創(chuàng)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦在知情選擇情況下于孕16～24周在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù),抽取20ml羊水進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片、閱片，羊水培養(yǎng)及制作核型的過(guò)程均按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，組間比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各年齡組NIPT結(jié)果分析 10 862例單胎孕婦中共檢出110例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)，其中<35歲組檢出67例，檢出率0.92%(67/7275)，35～39歲組檢出27例，檢出率0.89%(27/3018)，≥40歲組檢出16例，檢出率2.81%(16/569)。高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果中以21-三體和性染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)占比較大，分別為40.917%(45/110)和44.55%(49/110)，遠(yuǎn)高于18-三體的7.27%(8/110)和13-三體的7.72%(8/110)。不同年齡段NIPT高風(fēng)險(xiǎn)檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.406，P<0.001)，≥40歲組的NIPT高風(fēng)險(xiǎn)檢出率高于35～39歲及<35歲組(P<0.001)，具體情況見(jiàn)表1。

表1 不同年齡組NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的檢出情況

2.2 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的羊水染色體核型結(jié)果 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦需經(jīng)介入性產(chǎn)前診斷確診結(jié)果，經(jīng)知情選擇后110例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中91例進(jìn)行了羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水行染色體核型分析。經(jīng)染色體核型確診染色體異常的共60例，其中31例為21-三體、7例18-三體、2例13-三體以及20例性染色體異常。有31例孕婦染色體核型結(jié)果與NIPT結(jié)果不一致，其中74.19%(23/31)是性染色體異常結(jié)果。<35歲組共檢出染色體非整倍體34例，35～39歲組檢出15例，≥40歲組檢出11例，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同年齡組羊水染色體核型陽(yáng)性的檢出情況

2.3 NIPT在不同年齡組間檢測(cè)效能的比較 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦中91例選擇進(jìn)一步行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，其中60例經(jīng)染色體核型確診為染色體異常，與NIPT結(jié)果一致，NIPT總體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為65.93%(60/91)。經(jīng)電話隨訪，所有低風(fēng)險(xiǎn)孕婦中無(wú)假陰性病例存在。其中，<35歲組總體篩查符合率為99.67%(7242/7266)，35～39歲組總體篩查符合率為99.87%(3006/3010)，≥40歲組總體篩查符合率為99.47%(564/567)，不同年齡段的總體篩查符合率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=4.151，P=0.126)，各組對(duì)T21、T18和 T13的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及對(duì)性染色體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值具體情況見(jiàn)表3。

表3 不同年齡組各類型染色體非整倍體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年有80萬(wàn)～120萬(wàn)缺陷兒出生，占出生人口的4%～6%。其中，染色體異常占有重要比例，尤其是胎兒染色體非整倍體疾病(21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等)[7]。產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷是預(yù)防染色體異常出生缺陷的唯一手段。因此，選擇效率高，費(fèi)用適中，且能被大眾所接受的篩查方式是十分重要的。隨著我國(guó)女性接受教育的普及和文化水平的提高，職業(yè)女性中大部分選擇了晚婚晚育；近年來(lái)，國(guó)家二胎政策的全面放開(kāi)以及輔助生育技術(shù)的發(fā)展等原因使得高齡孕產(chǎn)婦的比例成倍的增加。然而，孕婦年齡與生育染色體異常胎兒的風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，隨著年齡增長(zhǎng)，卵巢儲(chǔ)備功能下降，卵泡刺激素升高，卵泡期縮短，卵泡發(fā)育的監(jiān)督機(jī)制出現(xiàn)問(wèn)題的概率增加，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的過(guò)程中發(fā)生染色體的異常分離，使得胎兒出現(xiàn)染色體異常的概率增多[8]。我國(guó)母嬰保健法規(guī)定，凡是年齡≥35歲的產(chǎn)婦都建議進(jìn)行產(chǎn)前診斷。介入性產(chǎn)前診斷雖然是作為診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，由于是有創(chuàng)操作，仍存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，如：流產(chǎn)、宮內(nèi)感染、胎兒損傷等；并且該技術(shù)還存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、技術(shù)要求高、可能存在培養(yǎng)失敗等缺陷[8]，不能被很多高齡孕婦接受。而無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)為高齡孕婦提供了一個(gè)很好的選擇。NIPT作為一項(xiàng)安全有效的篩查方法，相比傳統(tǒng)血清學(xué)篩查大大提高了篩查的準(zhǔn)確性，降低了假陽(yáng)性率。多項(xiàng)研究都證實(shí)了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查有很高的篩查效能，如果將該方法應(yīng)用于高齡孕婦可大大減少不必要的侵入性診斷，緩解高齡孕婦的焦慮心情。

本研究對(duì)2017年全年在廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心接受NIPT檢測(cè)的10 862例單胎孕婦進(jìn)行了回顧性分析。將其分為<35歲、35～39歲、≥40歲3組進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)≥40歲組NIPT檢出的高風(fēng)險(xiǎn)明顯高于其他兩個(gè)年齡組，并且≥40歲經(jīng)核型確診的染色體異常檢出率1.93%(11/569)也比<35歲的檢出率0.47%(34/7275)、35～39歲的檢出率0.50%(15/3018)有明顯增高，說(shuō)明年齡超過(guò)40歲的孕婦生育染色體異常兒的可能性明顯升高。并且在檢出的染色體異常類型中以21號(hào)染色體和性染色體非整倍體為主，與陳英蘋等[8]和莫偉英等[9]的研究結(jié)果類似。文獻(xiàn)中報(bào)道，21-三體是新生兒常見(jiàn)的染色體疾病，發(fā)病率高達(dá)1/800，而18-三體綜合征和13-三體綜合征的發(fā)病率分別為1/5000和1/7000，性染色體異常在男性胎兒發(fā)病率達(dá)1/500，女性胎兒發(fā)病率有1/850[10, 11]，本研究發(fā)現(xiàn)檢出的異常類型以21-三體和性染色體異常為主，這與21-三體和性染色體異常比18、13-三體在人群中的發(fā)病率更高是一致的。在NIPT篩查出的110例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，有91例選擇了介入性產(chǎn)前診斷進(jìn)行確診，其中有60例孕婦核型結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，31例結(jié)果不一致，假陽(yáng)性的結(jié)果中多數(shù)是性染色體異常，占了74.19%，這與不同年齡段中NIPT對(duì)性染色體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均較低的結(jié)果一致，可能與X染色體的GC含量偏移，X和Y染色體高度同源不易區(qū)分，以及Y染色體與其他染色體有較多相似片段導(dǎo)致性噪比降低等因素有關(guān)[11]。另外，有3例T21假陽(yáng)性，經(jīng)過(guò)追查分析得知，其中1例為母體自身存在低比例嵌合導(dǎo)致。造成NIPT假陽(yáng)性的原因有很多，限制性胎盤嵌合是最常見(jiàn)的原因，母體本身存在低比例嵌合以及拷貝數(shù)變異，雙胎之一消失，母體存在惡性腫瘤以及胎兒本身為嵌合體都可以引起無(wú)創(chuàng)假陽(yáng)性的發(fā)生[12]。由于無(wú)創(chuàng)檢測(cè)的是母體外周血中胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡釋放的胎兒游離DNA，胎兒游離DNA只占母體外周血的10%～20%，而無(wú)創(chuàng)試驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)辦法將母體的DNA完全去除，母體DNA仍占很大部分，因此當(dāng)母體存在染色體拷貝數(shù)異常時(shí)，可使檢測(cè)值異常升高，從而引起假陽(yáng)性。因此NIPT高風(fēng)險(xiǎn)需要進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷進(jìn)行確診。

本研究中，<35歲組對(duì)T21、T18和 T13的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別達(dá)93.75%、80.00%、25%，性染色體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為42.42%；35～39歲組對(duì)T21、T18和 T13以及性染色體非整倍體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別達(dá)90.00%、100.00%、100.00%、50.00%；≥40歲組對(duì)T21、T18、T13和性染色體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為87.50%、100.00%、0.00%、75.00%。其中，35～39歲和≥40歲兩組高齡組中21-三體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比低齡組反而低一點(diǎn)，可能是因?yàn)楦啐g孕婦沒(méi)有做唐氏綜合征篩查而選擇直接進(jìn)行無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，而低齡組基本都是唐氏綜合征產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)人群再進(jìn)一步行無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，從而使得更多異常被檢出。在不同年齡組中，NIPT對(duì)T21及T18的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較高，對(duì)T13和性染色體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值偏低，有大樣本量的研究顯示，NIPT對(duì)18-三體及13-三體篩查的準(zhǔn)確性比21-三體低，但仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查，研究顯示NIPT對(duì)13-三體及18-三體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)33%～90%和50%～70%，而血清學(xué)篩查的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值只為14%和3.4%[13, 14]，這也與我們的結(jié)果一致。且對(duì)比高齡組和低齡組，無(wú)創(chuàng)總體篩查符合率無(wú)差異，因此，NIPT檢測(cè)對(duì)于高齡和低齡孕婦同樣適用。

綜上所述，NIPT是一項(xiàng)安全、有效、快速、準(zhǔn)確的染色體非整倍體篩查方法，對(duì)于高齡孕婦同樣適用，具有很高的檢測(cè)效能，可降低高齡孕婦的穿刺率，減輕孕婦的焦慮。但是無(wú)創(chuàng)僅為一項(xiàng)篩查手段，仍存在假陽(yáng)性的情況，無(wú)創(chuàng)高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果必須經(jīng)過(guò)染色體核型確證，不能作為引產(chǎn)的依據(jù)。對(duì)于性染色體的篩查，還需進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和分析方法，以便更準(zhǔn)確地篩查出性染色體的異常。