3種氟喹諾酮聯(lián)合暴露對(duì)銅銹環(huán)棱螺的急性致死效應(yīng)

張小旭，馬陶武，李金曼，羅奔向，周影茹，何興兵，王萌

吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，吉首 416000

氟喹諾酮類抗生素(fluoroquinolones, FQs)是在以4-喹諾酮為基本骨架的基礎(chǔ)上引入氟原子，人工合成的一類抗生素[1]。FQs通過抑制DNA的促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，阻礙DNA的正常轉(zhuǎn)錄和復(fù)制從而產(chǎn)生殺菌作用[2]。常用的FQs包括環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、諾氟沙星(norfloxacin, NOR)和左氧氟沙星(levofloxacin, LEVO)(表1)。由于FQs具有抗菌范圍廣、抗菌活性強(qiáng)和價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)[3]，因此被廣泛使用于人畜疾病的預(yù)防與治療，其使用量近年來在世界范圍內(nèi)持續(xù)增長[4]。伴隨FQs的大量使用，其不可避免地進(jìn)入環(huán)境當(dāng)中。水環(huán)境是FQs的主要環(huán)境歸宿[5]，近年來，F(xiàn)Qs在全球范圍內(nèi)的水體中被頻繁檢出。其中河流和湖泊中的平均檢出濃度達(dá)到ng·L-1。如孫秋根等[6]對(duì)我國太湖流域中宜溧-洮滆水系中FQs的研究發(fā)現(xiàn)其中氧氟沙星(ofloxacin, OFL)的檢出率達(dá)到60.5%，F(xiàn)Qs總檢出濃度達(dá)到127～1 210 ng·L-1；Valdés等[7]在阿根廷的某河流中67%的樣本中檢測(cè)到FQs，其中OFL和CIP在上覆水中的最高檢出濃度分別為69 ng·L-1和78 ng·L-1；付雨等[8]在我國白洋淀水體中檢測(cè)出FQs的濃度達(dá)到0.738～2 004 ng·L-1；Wagil等[9]對(duì)波蘭河流中FQs檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其檢出濃度達(dá)到2.7 μg·L-1。

表1 3種氟喹諾酮類抗生素(FQs)的分子結(jié)構(gòu)Table 1 Molecular structure of 3 fluoroquinolones (FQs)

已有大量研究表明，進(jìn)入水環(huán)境中的FQs會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性作用，如導(dǎo)致水中微生物活性喪失和降低生物群落的多樣性[10]。FQs還會(huì)積累在魚類的組織中，影響魚的發(fā)育，損害其心血管和代謝系統(tǒng)，并改變魚的抗氧化和免疫反應(yīng)[11]。目前，關(guān)于FQs對(duì)水生生物的急性毒性效應(yīng)已引起了廣泛關(guān)注，研究結(jié)果表明水生生物暴露于高濃度的FQs中會(huì)對(duì)其產(chǎn)生急性致死效應(yīng)[12-13]。然而當(dāng)前關(guān)于FQs生態(tài)毒理的研究大多是基于單獨(dú)的某種FQs，而關(guān)于不同F(xiàn)Qs聯(lián)合作用的研究較少。在受FQs污染的水環(huán)境中，往往存在多種FQs[14]。如Du等[15]對(duì)鹽城沿海地區(qū)25種抗生素的分布調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一份樣品中至少檢出3種以上的FQs，且通過對(duì)FQs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估發(fā)現(xiàn)單一FQs對(duì)水生生物的風(fēng)險(xiǎn)較低，而混合FQs產(chǎn)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)可能高于預(yù)期風(fēng)險(xiǎn)；Liu等[16]調(diào)查膠州灣的濕地表層中FQs，發(fā)現(xiàn)所有樣品中都檢測(cè)到了FQs，共有8種FQs，其中NOR對(duì)環(huán)境可能達(dá)到中風(fēng)險(xiǎn)水平。鑒于此，為了合理評(píng)估FQs的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，需要針對(duì)不同種類FQs的聯(lián)合生態(tài)毒理開展研究。

我國生態(tài)環(huán)境部在2020年12月發(fā)布的《化學(xué)物質(zhì)環(huán)境與健康危害評(píng)估技術(shù)導(dǎo)則(試行)》[17]中明確指出，在進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)數(shù)據(jù)的篩選和評(píng)估時(shí)應(yīng)優(yōu)先采用我國本土生物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruginosa)屬于腹足綱田螺科的淡水軟體動(dòng)物，是我國淡水環(huán)境中一種主要底棲大型無脊椎動(dòng)物。近年來，已有大量使用銅銹環(huán)棱螺對(duì)污染物生態(tài)毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)的相關(guān)研究見諸報(bào)道[18-20]，本研究使用銅銹環(huán)棱螺幼螺為受試生物，以CIP、LEVO和NOR為目標(biāo)污染物，考察了3種FQs單一及聯(lián)合暴露的急性毒性效應(yīng)，分析了聯(lián)合作用模式。本研究結(jié)果可為合理評(píng)價(jià)FQs的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)，并為發(fā)展銅銹環(huán)棱螺在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 測(cè)試生物

本次實(shí)驗(yàn)所用的銅銹環(huán)棱螺種螺采自吉首市峒河濕地公園潔凈水體，在實(shí)驗(yàn)室人工控制條件下按照Ma[21]的方法進(jìn)行培養(yǎng)：采用上覆水(水溫(24±1) ℃，pH 7.99±0.15，硬度(78.4±3.3) mg·L-1)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)并連續(xù)繁殖，每日投喂一次商用魚飼料(三元牌，中國)，光周期為16 h∶8 h(光∶暗)。每日將新生幼螺挑出并單獨(dú)培養(yǎng)。本研究選擇同批次出生的大小均勻的健康幼螺(7日齡，(0.04±0.002) g)用于暴露實(shí)驗(yàn)。

1.2 個(gè)體毒性測(cè)試暴露方法

1.2.1 單一毒性測(cè)試

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將CIP和LEVO(98%，聯(lián)碩生物科技有限公司，中國)暴露濃度設(shè)置為25、50、100、200和400 mg·L-1，NOR(98%，聯(lián)碩生物科技有限公司，中國)暴露濃度設(shè)置為12.5、25、50、100和200 mg·L-1，并設(shè)空白對(duì)照組(0 mg·L-1)。每組設(shè)3個(gè)平行，所有溶液配制均使用超純水。暴露實(shí)驗(yàn)于90 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行，每個(gè)培養(yǎng)皿放入10只幼螺及46 mL對(duì)應(yīng)濃度的溶液。在生化培養(yǎng)箱(SPL-250，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司，中國)中于25 ℃下暴露96 h，每24 h更換暴露液，每8 h觀察并記錄死亡螺數(shù)量，以將幼螺取出放入清水中靜置觀察10 min，期間幼螺無主動(dòng)反應(yīng)為死亡依據(jù)，螺死亡后及時(shí)取出。為確保數(shù)據(jù)有效性，共進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)

1.2.2 二元、三元聯(lián)合毒性測(cè)試

培養(yǎng)皿中加入二元復(fù)合工作液(CIP+NOR、CIP+LEVO、NOR+LEVO)及三元復(fù)合工作液(CIP+NOR+LEVO)，其濃度均為相應(yīng)FQs單獨(dú)暴露下的10%致死濃度(LC10)、20%致死濃度(LC20)和半致死濃度(LC50)的等毒效應(yīng)比混合，每組設(shè)3個(gè)平行。

1.3 聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法

采用毒性單位法(TU)、混合毒性指數(shù)法(MTI)對(duì)CIP、NOR和LEVO二元、三元聯(lián)合毒性作用模式進(jìn)行分析。

毒性單位法和混合毒性指數(shù)法對(duì)聯(lián)合毒性作用模式的計(jì)算方法如公式(1)～(4)所示[22]。

TUi=Am/Ai

(1)

(2)

S0=S/(TUi)max

(3)

MTI=1-lgS/lgn

(4)

式中：TUi為混合物中i組分的毒性單位；Am為聯(lián)合染毒后混合物中i組分相應(yīng)的LC值(mg·L-1)；Ai為i組分單獨(dú)染毒后相應(yīng)的LC值；S為各組分生物毒性單位相加之和；(TUi)max為混合物中所有組分的毒性單位的最大值；S0為生物毒性單位之和與毒性單位最大值的比值；MTI為混合毒性指數(shù)；n為混合物中各組分的種類個(gè)數(shù)。

聯(lián)合毒性作用分為獨(dú)立、相加、協(xié)同和拮抗4種作用類型，判斷依據(jù)如表2所示[23]。

表2 聯(lián)合毒性作用類型判斷方法Table 2 Combined toxicity type judgment method

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0軟件，采用Probit回歸模型分析計(jì)算LC10、LC20和LC50值；使用OriginLab 2021繪制隨著時(shí)間和濃度增加死亡數(shù)變化的柱狀圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 單一暴露致死效應(yīng)

圖1顯示了3種FQs在不同暴露時(shí)間段和濃度下銅銹環(huán)棱螺的死亡數(shù)量?？傮w而言，死亡數(shù)量與FQs暴露時(shí)間和濃度呈正比。如圖1(a)所示，在25 mg·L-1和200 mg·L-1CIP下暴露24 h不會(huì)導(dǎo)致幼螺發(fā)生死亡，死亡主要發(fā)生在暴露48 h，隨著暴露時(shí)間的增加，死亡數(shù)隨暴露濃度的增加而顯著增加，最高暴露濃度下的幼螺死亡率最高；如圖1(b)所示，在最低和最高濃度NOR下暴露24 h不造成幼螺死亡，死亡主要出現(xiàn)在72 h，隨著暴露時(shí)間的增加死亡數(shù)增加；如圖1(c)所示，LEVO暴露下死亡主要出現(xiàn)在24 h，其中100 mg·L-1處理組的死亡數(shù)在72 h時(shí)顯著上升，96 h死亡數(shù)有所降低但仍高于24 h和48 h，在高濃度處理組(200 mg·L-1和400 mg·L-1)中，隨著暴露時(shí)間的增加，死亡數(shù)有所增長。3種FQs對(duì)螺的急性致死效應(yīng)按大小排列依次為NOR>CIP>LEVO。根據(jù)死亡數(shù)計(jì)算出96 h LC10、LC20和LC50如表3所示。

圖1 FQs暴露不同時(shí)間下銅銹環(huán)棱螺死亡數(shù)量注：(a) CIP；(b) NOR；(c) LEVO。Fig. 1 Number of dead Bellamya aeruginosa under FQs exposure at different timeNote:(a) CIP; (b) NOR; (c) LEVO.

表3 3種FQs暴露96 h對(duì)銅銹環(huán)棱螺幼螺的致死效應(yīng)Table 3 Lethal effects of 3 kinds of FQs on Bellamya aeruginosa larva after exposure for 96 h (mg·L-1)

2.2 聯(lián)合暴露致死效應(yīng)

二元體系(CIP+LEVO、CIP+NOR和NOR+LEVO)及三元體系(CIP+LEVO+NOR)對(duì)銅銹環(huán)棱螺幼螺的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)分別如表4～7所示。由表4可知，CIP和LEVO聯(lián)合暴露下，對(duì)螺的毒性作用在24 h均表現(xiàn)為拮抗作用；48 h LC10、LC20表現(xiàn)為協(xié)同作用，48 h LC50表現(xiàn)為拮抗作用；96 h LC10、LC20表現(xiàn)為協(xié)同作用，96 h LC50表現(xiàn)為部分相加作用。CIP和NOR(表5)以及NOR和LEVO(表6)聯(lián)合暴露下表現(xiàn)出相同的作用，即對(duì)螺的毒性作用在24 h和48 h時(shí)均表現(xiàn)為拮抗作用，然而，在暴露至96 h時(shí)，轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同作用。CIP、NOR和LEVO聯(lián)合暴露24 h對(duì)螺的毒性作用均為拮抗作用；48 h LC10表現(xiàn)為協(xié)同作用，48 h LC20表現(xiàn)為部分相加作用，48 h LC50表現(xiàn)為拮抗作用，96 h均表現(xiàn)為協(xié)同作用(表7)。

表4 CIP和LEVO聯(lián)合暴露對(duì)銅銹環(huán)棱螺幼螺的毒性作用Table 4 Toxic effects of CIP and LEVO combined exposure on Bellamya aeruginosa larva

表5 CIP和NOR聯(lián)合暴露對(duì)銅銹環(huán)棱螺幼螺的毒性作用Table 5 Toxic effects of CIP and NOR combined exposure on Bellamya aeruginosa larva

表6 NOR和LEVO聯(lián)合暴露對(duì)銅銹環(huán)棱螺幼螺的毒性作用Table 6 Toxic effects of NOR and LEVO combined exposure on Bellamya aeruginosa larva

表7 CIP、NOR和LEVO聯(lián)合暴露對(duì)銅銹環(huán)棱螺幼螺的毒性作用Table 7 Toxic effects of CIP, NOR and LEVO combined exposure on Bellamya aeruginosa larva

3 討論(Discussion)

本次研究中的3種FQs單一暴露下幼螺死亡數(shù)均隨著時(shí)間和濃度的增加呈上升趨勢(shì)。與本研究結(jié)果類似，Peltzer等[24]的研究表明，隨著暴露于低濃度FQs的時(shí)間和濃度的增加，蟾蜍幼蟲(Rhinellaarenarum)生長和發(fā)育受到的影響會(huì)逐漸增加。Shen等[25]研究了多種FQs單一暴露24 h后斑馬魚的致死率，發(fā)現(xiàn)斑馬魚的致死率隨著FQs濃度的增加而升高，與本次實(shí)驗(yàn)中銅銹環(huán)棱螺幼螺死亡率隨濃度的增加而升高一致。通過比較本研究中3種FQs間的LC50可知NOR的毒性大于CIP和LEVO。He等[18]用NOR和OFL對(duì)銅銹環(huán)棱螺幼螺進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)NOR的毒性大于OFL。根據(jù)《新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估導(dǎo)則》(HJ/T 154—2004)[26]，化學(xué)品生態(tài)毒理學(xué)危害性按LC50可分為極高(≤1 mg·L-1)、高(>1～10 mg·L-1)、中(>10～100 mg·L-1)和低(>100 mg·L-1)。據(jù)此，CIP和LEVO對(duì)銅銹環(huán)棱螺幼螺屬低度生態(tài)毒理學(xué)危害，而NOR屬于中度危害。

目前關(guān)于不同F(xiàn)Qs間聯(lián)合毒性作用的研究已有一些報(bào)道，如Riaz等[27]研究了CIP、LEVO和恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)聯(lián)合暴露對(duì)小麥萌發(fā)和溫室沙土培養(yǎng)下的短期毒性，結(jié)果表明FQs在低濃度下便會(huì)發(fā)生協(xié)同毒性作用；Wang等[14]探究了紅霉素和ENR單一及聯(lián)合暴露對(duì)小球藻的毒性，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露對(duì)小球藻的抗氧化和光合系統(tǒng)有更大的刺激作用。上述研究結(jié)果與本文中暴露96 h后各濃度產(chǎn)生的毒性作用趨向于協(xié)同作用的結(jié)果一致，指示不同種類FQs的聯(lián)合污染產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。此外，本研究結(jié)果還顯示，在暴露至24 h時(shí)聯(lián)合毒性作用均為拮抗，而在96 h時(shí)絕大部分均轉(zhuǎn)為協(xié)同作用，僅有CIP+LEVO在LC50濃度下為部分相加作用。Magdaleno等[28]用6種抗生素分別二元聯(lián)合對(duì)羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)進(jìn)行了復(fù)合暴露，結(jié)果表明聯(lián)合暴露產(chǎn)生的毒性作用在前期為拮抗作用，后期為協(xié)同作用，這與本研究結(jié)果一致。對(duì)于聯(lián)合暴露毒性在前期表現(xiàn)為拮抗作用的原因可能是不同化合物間在生物體內(nèi)發(fā)生了競(jìng)爭(zhēng)吸收作用[29]。Xu等[30]的研究指出CIP可通過下調(diào)藥物代謝酶CYP3A29的基因表達(dá)和阻礙CYP3A29與ENR的結(jié)合而延緩ENR在豬肝臟中的代謝，這可能是本研究中不同F(xiàn)Qs間聯(lián)合暴露毒性最終趨向協(xié)同作用的潛在機(jī)制。

目前針對(duì)FQs對(duì)水生生物毒性的研究大多使用國際上通用的模式生物，如Han等[31]研究了17種FQs對(duì)斑馬魚胚胎的致死效應(yīng)，研究結(jié)果表明CIP和LEVO的LC50分別為619.618 mg·L-1和5 420.595 mg·L-1；Xi等[12]的研究表明1 200 mg·L-1的NOR對(duì)斑馬魚胚胎暴露96 h后，死亡率為46.7%。相比于本次實(shí)驗(yàn)所使用的銅銹環(huán)棱螺幼螺，上述研究中FQs對(duì)斑馬魚胚胎的LC50較高，指示銅銹環(huán)棱螺幼螺對(duì)FQs暴露的敏感性更高。Kergaravat等[32]使用大型溞(Daphniamagna)和網(wǎng)紋溞(Ceriodaphniadubia)研究了莫西沙星(MOXI)的生態(tài)毒性，結(jié)果顯示大型溞暴露48 h和72 h的LC50分別為14.2 mg·L-1和3.4 mg·L-1，網(wǎng)紋溞暴露48 h和72 h的LC50分別為29.2 mg·L-1和5.4 mg·L-1，表明水溞類對(duì)FQs暴露較為敏感。大量研究證實(shí)FQs在進(jìn)入水環(huán)境后傾向于富集于沉積物當(dāng)中，其在沉積物中濃度遠(yuǎn)高于地表水[33]，因此開展基于沉積物介質(zhì)的FQs生態(tài)毒理研究具有重要科學(xué)意義。為順利開展該方面的研究迫切需要一種營沉積物棲居且對(duì)FQs較為敏感的受試生物，本研究結(jié)果表明本土淡水底棲大型無脊椎動(dòng)物銅銹環(huán)棱螺對(duì)FQs暴露較為敏感，是一種適合開展FQs在我國水環(huán)境尤其是沉積物中生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的受試生物。

當(dāng)前關(guān)于FQs對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)已受到大量關(guān)注，然而對(duì)于不同F(xiàn)Qs的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究較少。本研究考察了3種FQs單一及聯(lián)合暴露對(duì)本土生物銅銹環(huán)棱螺幼螺的致死效應(yīng)。單一暴露結(jié)果表明NOR對(duì)銅銹環(huán)棱螺幼螺為中度危害，而CIP和LEVO為低度危害。銅銹環(huán)棱螺對(duì)FQs暴露較為敏感，是一種適合開展FQs在我國水環(huán)境中生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的受試生物。聯(lián)合暴露研究結(jié)果顯示3種FQs的毒性作用趨向于協(xié)同作用，指示盡管FQs單獨(dú)暴露導(dǎo)致的毒性效應(yīng)較低，然而鑒于不同F(xiàn)Qs往往共存于水環(huán)境當(dāng)中，其聯(lián)合毒性作用可能會(huì)導(dǎo)致更高的水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，需對(duì)其開展深入研究。