不同劑量復合維生素對H9N2亞型禽流感病毒感染小鼠有效保護效果研究

董宏偉,鄭 豐,李永彬

(河南省駐馬店市動物疫病預防控制中心，河南 駐馬店 463000)

H9N2亞型禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒(LPAIV)，最早于1966年從患輕度呼吸道疾病的火雞上分離得到，被命名為A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)[1]。近年來，H9N2亞型禽流感的流行變得日益頻繁，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，并對人類健康構成威脅，有效防治禽流感仍是一個亟待解決的難題。目前，控制禽流感的措施主要依賴于疫苗和抗病毒藥。病毒抗原漂移或抗原轉換帶來的病毒持續(xù)變異，使AIV可逃逸動物機體已有的免疫應答，流感疫苗僅對亞型內(nèi)抗原匹配較好的毒株具有免疫保護作用，往往對下一次的疫情起不到保護作用，難以應對流感大流行；流感病毒對抗病毒藥物極易產(chǎn)生耐藥性。

維生素在調(diào)節(jié)免疫過程中有廣泛且重要的作用，比如淋巴細胞活化和增殖，輔助性T細胞的分化、組織特異性淋巴細胞歸巢，特異性抗體產(chǎn)生和免疫反應的調(diào)節(jié)。VC、VE和B族維生素作為抗氧化劑，以非特異性的方式發(fā)揮免疫作用；而VA和VD有激素樣特性，通過與核激素受體的相互作用，在免疫應答中發(fā)揮著關鍵作用，其代謝物在調(diào)節(jié)組織特異性免疫反應、預防或治療炎癥方面有一定潛力[2]?；诖耍驹囼灢捎酶?、中、低3個不同濃度的復合維生素給小鼠灌服，通過觀察小鼠臨床癥狀、存活狀況、體溫、體重和采食量的變化，以確定復合維生素給藥劑量，從而增強對AIV的抵抗力，為H9N2亞型禽流感的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

手提式壓力蒸汽滅菌器(YX-280D)(合肥華泰醫(yī)療設備有限公司)， 電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司)，電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)， 超低溫冰箱(上海精天電子儀器有限公司)， 垂直流超凈工作臺(上海智成分析儀器制造有限公司)，電子天平(上海第二天平儀器廠) 。

1.2 病毒及實驗動物

A/Chicken/HB/4/2008(H9N2) EID50為10-8.78/0.2mL本課題組分離、保存。6-8周齡雄性SPF BALB/c系小鼠(購于北京維通利華實驗動物技術有限公司)。

1.3 藥品

Retinyl acetate(批號1001019413，Sigma公司)，維生素C注射液(批號 H20046089，辰欣藥業(yè)股份有限公司)，維生素D2果糖酸鈣注射液(批號 H44024177，天心制藥有限公司)，(±)-α-Tocopherol(批號1001006848，Sigma公司)。

1.4 主要試劑的配制

生理鹽水NaCl0.85g，去離子水100mL，完全溶解，高壓滅菌。

0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.63g，KH2PO40.24g，去離子水900mL用鹽酸調(diào)pH值至7.4，加去離子水定容至1000mL，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1萬U/mL雙抗液注射用青霉素80萬單位，注射用鏈霉素80萬單位，PBS80mL，完全溶解后，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察不同劑量復合維生素對小鼠臨床癥狀和存活率的影響

表1 不同組復合維生素的組分劑量

取6-8周齡18-20 g雄性SPF BALB/c系小鼠30只隨機分為4組，按常規(guī)方法飼養(yǎng)。各組維生素劑量見表1。設置對照組，每天給小鼠灌胃復合維生素液或生理鹽水200 μL，連續(xù)灌胃10 d，11 d時鼻腔接種A/Chicken/HB/4/2008(H9N2)病毒的感染性雞胚尿囊液200 μL/只，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)和死亡情況并作好記錄，連續(xù)觀察31 d。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以(X±SE)表示。用SPSS for Windows 13.0 統(tǒng)計軟件包進行t檢驗(Independent samplettest),P<0.05判為差異顯著。

2 實驗結果

2.1 復合維生素對H9N2亞型禽流感病毒感染小鼠臨床癥狀和存活狀況的影響

攻毒組小鼠，在攻毒后第1天整體狀態(tài)良好；攻毒后第2天開始出現(xiàn)精神沉郁，活動減少，扎堆，體溫、體重和采食量均大幅下降；攻毒后第3天癥狀比較明顯，大部分小鼠精神高度沉郁，不活動或活動緩慢，被毛粗亂無光澤，呼吸呈弓背呼吸，出現(xiàn)呼吸震顫音，表現(xiàn)出呼吸困難和呼吸窘迫等典型流感癥狀(圖1A)，嚴重的呼吸窘迫持續(xù)3 d，存活小鼠從攻毒后第7天體征逐步恢復，第14天基本恢復至正常水平。維生素組也出現(xiàn)上述癥狀，但是癥狀較輕且高劑量維生素組癥狀最輕，恢復更早(圖1B)。

圖1 感染H9N2后第6天小鼠臨床表現(xiàn)變化

存活率：感染后4-6 d為小鼠死亡高峰期，攻毒組在感染后開始死亡，觀察期內(nèi)攻毒組與維生素組存活率均為33%(6/18),對照組小鼠存活率為100%(圖2)。維生素組小鼠開始死亡時間為144 h，比攻毒組小鼠110 h推遲了34 h，說明4種復合維生素對小鼠有一定的保護作用。

圖2 維生素組以及對照組小鼠的存活曲線

2.2 不同劑量復合維生素對小鼠體溫、體重等臨床癥狀的影響

灌胃期間各組體溫穩(wěn)定，維持在37-38 ℃之間，接種病毒后，除對照組體溫穩(wěn)定，其余各組體溫均呈現(xiàn)先下降后上升態(tài)勢，攻毒組與各維生素組體溫均在接種后第2天下降，攻毒組、低劑量維生素組和中劑量維生素組分別在第5、6、8天達到最低，高劑量給藥組第2天達到最低，但最低值明顯高于攻毒組，隨后，各組恢復期間體溫緩慢回升(圖3)。

圖3 維生素組以及對照組小鼠體溫變化情況

對照組小鼠在實驗期間體重緩慢上升，高劑量維生素組、中劑量維生素組、低劑量維生素組和攻毒組分別在攻毒后第3、7、8天下降至最低，高劑量維生素組明顯高于對照組，且體重降低7%，明顯低于其他組22%～30%。之后各組體重不斷恢復，高劑量和中劑量維生素組體重始終高于攻毒組(圖4)。

圖4 維生素組以及對照組小鼠體重變化情況

接種病毒第2天，除對照組，其余各組采食量下降(圖5)，第3天均降至最低點，下降和恢復期間，各組采食情況為：高劑量維生素組>中劑量維生素組>攻毒對照組>低劑量維生素組。

綜合各組臨床癥狀、存活狀況、體溫、體重和采食量的情況，高劑量維生素組和中劑量維生素組對H9N2亞型流感病毒起到一定保護作用，前者保護作用更好。

3 討論

H9N2亞型禽流感病，于1966年首次從火雞中被檢測，現(xiàn)在已呈全球流行,其宿主范圍不斷擴大，包括人類、狗、豬、雞、鴨、鵪鶉、野雞、鵪鶉、鴿子、烏骨雞、石雞和白鷺等[70]。H9N2亞型禽流感通常不會引起明顯的臨床癥狀或雞只死亡，表現(xiàn)為輕度的發(fā)病率和死亡率，但是與其他病原菌共感染則會給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大損失[4]。此外，H9N2亞型流感病毒已經(jīng)在家禽中建立了穩(wěn)定的種系，在多種宿主中流行并持續(xù)變異，如H6N1，H6N2、H5N1、H7N9和H10N8，可能產(chǎn)生感染人類的重組毒株，帶來公共衛(wèi)生安全隱患[3, 5]。因此，有效防控H9N2對養(yǎng)殖業(yè)危害和人類公共衛(wèi)生安全具有雙重意義。H9N2亞型禽流感病毒屬低致病性病毒，常表現(xiàn)為隱性感染或僅表現(xiàn)輕微癥狀，未能引起人們足夠重視；由于病毒不斷變異和重組，疫苗保護效果不斷下降；抗流感藥物如金剛烷胺、金剛乙胺的頻繁使用，已出現(xiàn)耐藥性，對流感病毒的敏感性也越來越低。因此，需要繼續(xù)尋求有效的防控H9N2亞型禽流感的方法。

維生素是人和動物必須從食物中獲得的一類微量有機物質，在機體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，不同維生素在麻疹、艾滋病、流感的預防或治療上有一定作用。本實驗采用高、中、低3個不同濃度的四種復合維生素給小鼠灌服，觀察其對H9N2亞型禽流感病毒感染小鼠的保護效果。每天給予800 IU VA、25 mg VC、12 IU VD和3.2 IU VE的高劑量復合維生素組小鼠感染H9N2亞型禽流感病毒后精神狀態(tài)、體溫和采食量的維持明顯好于其他組，尤其在體重方面，感染后體重降低7%，明顯低于其他組22%～30%。本實驗結果顯示，高劑量復合維生素對H9N2亞型禽流感感染的小鼠能起到保護作用。