貯存溫度及形態(tài)對(duì)甜櫻桃花粉耐貯性的影響研究

張 琦,劉 濤,王雅楠,支玉璽,高慶，蔡宇良*

( 1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.武功縣園林工作站，陜西武功 712200)

歐洲甜櫻桃(Cerasusavium)為薔薇科(Rosaceae)櫻屬(Cerasus)植物[1]，又稱甜櫻桃、西洋櫻桃、大櫻桃，歐洲甜櫻桃較中國(guó)櫻桃、毛櫻桃、酸櫻桃有著外形美觀、鮮艷亮澤、果實(shí)大、果肉多厚且柔軟多汁、味道甜美、口感好、耐儲(chǔ)運(yùn)等明顯優(yōu)點(diǎn)。櫻桃素有“百果第一枝”、“水果中的鉆石”等美譽(yù)，春末夏初(4月下旬至6月下旬)成熟，櫻桃的上市填補(bǔ)了新鮮水果的市場(chǎng)空白，對(duì)調(diào)節(jié)鮮果供應(yīng)、平衡市場(chǎng)供需與滿足人民對(duì)美好生活的需要有很大的意義和作用[2]。此外櫻桃加工產(chǎn)品以其營(yíng)養(yǎng)健康、種類豐富和較高品質(zhì)廣泛受到市場(chǎng)和消費(fèi)者追捧。甜櫻桃以其優(yōu)良的果品特性、較高的商品價(jià)值、較早的上市時(shí)間近年來(lái)一直將我國(guó)櫻桃產(chǎn)業(yè)的主導(dǎo)地位牢牢占據(jù)[3]。

櫻桃為雌雄同花，中國(guó)櫻桃與酸櫻桃花粉多、自花結(jié)實(shí)能力強(qiáng)，除艷陽(yáng)、拉賓斯、斯坦勒、斯塔克、艷紅等少數(shù)品種有較高的自花結(jié)實(shí)能力外大部分甜櫻桃品種都明顯的自花不實(shí)，而且品種之間的親和性也存在很大不同。在果樹(shù)生產(chǎn)中，往往因?yàn)楣麍@中搭配的授粉樹(shù)少、品種不合理，加之受到天氣影響，例如果樹(shù)在花期遭遇大風(fēng)、低溫而造成蜜蜂不能進(jìn)行正常的自然授粉而造成產(chǎn)量、品質(zhì)下降，同時(shí)隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，甜櫻桃設(shè)施保護(hù)地栽培的大力推廣，由于其栽培環(huán)境與生長(zhǎng)習(xí)性的改變，出現(xiàn)了花粉生活力普遍較低的現(xiàn)象，其中有的甚至不足10%，較低的花粉生活力是設(shè)施櫻桃開(kāi)花卻不坐果的主要原因之一[4]。對(duì)于自花不實(shí)的果樹(shù)提高結(jié)實(shí)率的最關(guān)鍵、最有效途徑就是進(jìn)行品種間的異花授粉，同時(shí)人工授粉也是雜交選育櫻桃新品種、提高櫻桃品質(zhì)、抵抗花期惡略自然環(huán)境的重要途徑，而通過(guò)授粉受精獲得優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)，培育出新品種的基礎(chǔ)就是花粉生活力，果園的產(chǎn)量和雜交試驗(yàn)的成敗直接受到花粉數(shù)量多少和生活力高低的影響[5]。因此，通過(guò)建立花粉預(yù)備制度，提前采集自然條件下的高生活力花粉進(jìn)行貯存保鮮，待大田甜櫻桃花期遇到不良天氣、大棚甜櫻桃花期、開(kāi)展雜交育種工作時(shí)進(jìn)行人工授粉可以促進(jìn)甜櫻桃生產(chǎn)、科研的優(yōu)質(zhì)、高效[6]。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

1.1.1 試驗(yàn)材料

供試材料有：先鋒、艷陽(yáng)、吉美、雷尼、斯坦拉共5個(gè)甜櫻桃品種花粉，2017年4 月初、2018年3月中下旬于陜西省西安市周至縣二曲鎮(zhèn)渭中村西北農(nóng)林科技大學(xué)渭河櫻桃試驗(yàn)示范站和陜西省寶雞市眉縣試驗(yàn)站采集，分別用于花粉生活力測(cè)定、貯存試驗(yàn)和花粉數(shù)量、含水量的測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉的采集、制作、保存

(1)花粉的采集制作

根據(jù)花的開(kāi)放程度分時(shí)對(duì)先鋒、艷陽(yáng)、吉美等5個(gè)不同甜櫻桃品種分別采集花朵以收集花粉。在各品種花蕾期采集雄蕊松散、花藥變黃但尚未開(kāi)放的“鈴鐺花”，每個(gè)品種采集至少500朵花，采下后立即放入4 ℃恒溫冰箱內(nèi)。在避風(fēng)條件下迅速用鑷子將花藥從雄蕊上剝離，將各個(gè)品種花藥分品種標(biāo)記后，分別置于25 ℃條件下烘干24 h。

(2)研磨前處理

花粉保存形態(tài)設(shè)置花藥和花粉兩個(gè)水平，待花藥干燥后，將一部分干燥好的花藥進(jìn)行研磨處理，研磨時(shí)將花藥放在硫酸紙紙夾層中，使用光滑的器具輕輕反復(fù)研磨，將未散粉的花藥壁擠破，使其中的花粉充分釋放出來(lái)，研磨時(shí)要注意研磨力度，謹(jǐn)防機(jī)械損傷導(dǎo)致花粉破裂而失活，將釋放出來(lái)的花粉過(guò)60目篩后收集至離心管中；另一部分直接收集在離心管中，用密封紙、錫箔包裹兩層后做好標(biāo)記裝入自封袋中。

(3)貯存溫度試驗(yàn)處理

花粉貯存溫度分為4個(gè)水平，將花藥、花粉分別置于室溫(14～19 ℃)和4、-20、-80 ℃恒溫條件下。各處理重復(fù)3次。

1.2.2 花粉數(shù)量測(cè)定 采用蔗糖懸浮液法和果膠酶酶解法對(duì)吉美、艷陽(yáng)、先鋒三個(gè)甜櫻桃品種花粉數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，將兩種懸浮液的測(cè)定效果進(jìn)行對(duì)比，分別選用載玻片直接計(jì)數(shù)法和血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定單克花粉量和單藥出粉量，重復(fù)6次[7-8]。單藥花粉量和單克花粉量計(jì)算公式如下：

單藥花粉量(粒)=(每個(gè)載玻片上總花粉粒數(shù)×200)/12

單克花粉量(粒)=5個(gè)中方格的花粉粒數(shù)/5×10×103×100

1.2.3 花粉含水量測(cè)定 采用王小敏等[9]的烘干法測(cè)定花粉含水量，將新鮮花粉置于干燥的稱量盒中，烘箱設(shè)定溫度25 ℃，待24，48，72 h直至恒重取出測(cè)定重量，通過(guò)計(jì)算得出各品種花粉含水量值。

花粉含水量=(W2-W3)/(W2-W1)×100%(W1為干燥的稱量盒重，W2為稱量盒內(nèi)放入花粉后重，W3為干燥后恒重)。

1.2.4 花粉生活力測(cè)定 取已滅菌的潔凈雙凹載玻片，在載玻片凹處滴加經(jīng)滅菌后的15%蔗糖、15 mg·L-1硼酸、0.5%瓊脂的培養(yǎng)基溶液[10]2～3滴，確保蓋玻片蓋上后不溢出，待培養(yǎng)基溶液凝固后，將少許花粉粒播于培養(yǎng)基中，蓋上蓋玻片。于23～25 ℃組織培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)48 h[11]后在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的情況，以花粉管伸長(zhǎng)超過(guò)花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)[12]。每品種重復(fù)3次，各重復(fù)按梅花法隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)重復(fù)中觀察不少于100?；ǚ?，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

花粉生活力=(花粉管長(zhǎng)度大于花粉粒直徑的花粉數(shù)量/觀察花粉數(shù)量)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Office Excel 2016軟件作圖并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 花粉含水量

對(duì)斯坦拉、艷陽(yáng)、先鋒、雷尼、吉美5個(gè)甜櫻桃品種進(jìn)行花粉含水量測(cè)定，各品種花粉分別在稱量瓶?jī)?nèi)烘干24，48，72，72，96 h達(dá)到恒重，花粉含水量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，晚熟品種吉美花粉含水量最高為68.62%，分別高出中熟品種艷陽(yáng)、先鋒、雷尼花粉10.34%，19.99%，24.5%，高出早熟品種斯坦拉28.97%，。此外，不同品種花粉在25 ℃條件下烘干24 h后平均含水量不同，為4.98%～6.10%，從高到低依次為吉美、艷陽(yáng)、先鋒、雷尼、斯坦拉。

表1 不同甜櫻桃品種花粉含水量 單位：%

注：表中“±” 后數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，下同。

2.2 花粉數(shù)量

采用果膠酶酶解法所測(cè)得的單藥出粉量、單克花粉量如表2所示。先鋒、吉美、艷陽(yáng)的單藥平均出粉量分別為2 711粒、2 120粒、1 952粒。其中，先鋒的單藥出粉量分別較吉美和艷陽(yáng)高27.88%和38.88%，而吉美和艷陽(yáng)的單藥出粉量無(wú)顯著差異。吉美、艷陽(yáng)、先鋒的單克花粉量分別為51.3×106，20.0×106，50.4×106。其中，先鋒和吉美的單克花粉量顯著高于艷陽(yáng)，而前兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 不同品種甜櫻桃花粉數(shù)量 單位：粒

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

據(jù)采集時(shí)統(tǒng)計(jì)，吉美、艷陽(yáng)、先鋒的單花出藥量分別為30粒、32粒、38粒，由表2可計(jì)算出吉美、艷陽(yáng)、先鋒三種甜櫻桃的單花出粉量，計(jì)算結(jié)果表明，在三種供試甜櫻桃中，單花出粉量最多的先鋒為103 000粒，其次為吉美64 000粒，艷陽(yáng)最少為62 000粒。

2.3 花粉生活力

25 ℃烘干24 h后采用花粉離體培養(yǎng)法測(cè)定的吉美、艷陽(yáng)、先鋒、雷尼、斯坦拉等5個(gè)甜櫻桃品種花粉生活力如圖1所示，可看出5個(gè)品種中先鋒花粉生活率最高，為66.74%，艷陽(yáng)次之，為49.29%，雷尼花粉生活力最低為43.44%?？梢?jiàn)在25 ℃烘箱內(nèi)烘干24 h后花粉生活力仍保持較高的水平。

圖1 不同品種甜櫻桃25 ℃條件下烘干24 h的花粉生活力)

2.4 貯存形態(tài)對(duì)花粉生活力的影響

由圖2可知，在室溫和4 ℃條件下吉美、先鋒以花粉形態(tài)貯存與以花藥形態(tài)貯存的效果大致相同，艷陽(yáng)以花藥形態(tài)貯存的花粉生活力高于以花粉形態(tài)貯存的花粉，其差值最高可達(dá)27.24%，其中4 ℃條件下以花粉形態(tài)貯存的艷陽(yáng)花粉完全失活時(shí)間早于以花藥形態(tài)貯存的花粉最長(zhǎng)，可達(dá)90 d。在-20 ℃和-80 ℃下保存，吉美前7 d中以花粉形態(tài)貯存的花粉生活力高于以花藥形態(tài)貯存的花粉，隨后低于以花藥形態(tài)貯存的花粉，在-20 ℃第225 d時(shí)，其差值達(dá)到最大值，為28.77%；艷陽(yáng)以花藥形態(tài)貯存的花粉生活力在貯存過(guò)程中均高于以花粉形態(tài)貯存的花粉生活力，在第255 d時(shí)差值最大為32.98%；先鋒在長(zhǎng)期貯存過(guò)程中，除-80 ℃溫度下第285 d外，以花藥形態(tài)貯存的花粉生活力僅略高于以花粉形態(tài)貯存的花粉生活力?？傮w上看，長(zhǎng)期貯存過(guò)程中以花藥形態(tài)貯存的花粉生活力高于花粉形態(tài)貯存的花粉。

2.5 貯存溫度對(duì)花粉生活力的影響

室溫下吉美、艷陽(yáng)、先鋒三種甜櫻桃花粉生活力均在貯存前5 d內(nèi)明顯下降，15 d時(shí)花粉生活力均降低至10%以下，45 d時(shí)完全失去生活力。可見(jiàn)，室溫不適用于花粉的貯存。在貯存的第45 d后，在4、-20、-80 ℃溫度條件下貯存的花粉生活力下降速度較之前逐漸放緩。貯存時(shí)間達(dá)120 d后花粉生活力呈現(xiàn)明顯降低趨勢(shì)，4 ℃降低最快，-20、-80 ℃貯存的花粉生活力損失較小。在4 ℃中貯存的花粉在第165 d時(shí)出現(xiàn)多數(shù)萌發(fā)率、染色率為零的視野，萌發(fā)率降低至10%左右，此時(shí)貯存價(jià)值較低，吉美、艷陽(yáng)在第195 d即完全失活，先鋒在貯存第315 d完全失活，已失去貯存價(jià)值。貯存第225 d時(shí)，在-20 ℃下貯存的艷陽(yáng)花粉生活力降低至37.92%，與貯存前相差近11個(gè)百分點(diǎn)。各品種-80 ℃下貯存的花粉生活力與-20 ℃溫度下貯存的花粉基本相當(dāng)，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，觀察到的花粉管長(zhǎng)度呈漸短趨勢(shì)，花粉萌發(fā)的一致性較未貯存之前差。當(dāng)花粉在-20、-80 ℃繼續(xù)貯存至365 d時(shí)，各品種花粉生活力均有較為明顯的下降，各品種花粉生活力為23.32%～36.22%。可見(jiàn)，甜櫻桃花粉在-20 ℃和-80 ℃溫度條件下進(jìn)行周年貯存可滿足科研和生產(chǎn)中人工授粉對(duì)花粉生活力的需求。

3 討論與結(jié)論

甜櫻桃單藥花粉量分為5類，粒數(shù)小于700粒為極少量，201～1 400粒的為少量，1 401～2 100粒為中等，2 101～2 800粒為多，2 800粒以上為極多[13]，吉美、先鋒單藥出粉量多，而艷陽(yáng)出粉量中等。度的干燥有利于花粉的保存，20%以下的花粉含水量有利于桃花粉超低溫保存其中以13%～21%最佳[14]，蔗茅花粉含水量在10%以下、垂絲海棠花粉含水量為10%時(shí)置于低溫條件下可延長(zhǎng)其貯存時(shí)間[15-16]。本試驗(yàn)中吉美、艷陽(yáng)、先鋒、斯坦拉、雷尼五個(gè)甜櫻桃花粉總含水量在介于39.65%～68.62%間，且含水量越高的花粉表現(xiàn)出的花粉生活力越低。在25 ℃溫度條件下烘干24 h后含水率降至4.98%～6.1%，此時(shí)花粉生活力為43.44%～66.74%，可見(jiàn)在25 ℃烘箱內(nèi)烘干24 h可作為花粉貯存前的干燥處理方法，但25 ℃烘干24 h是否是甜櫻桃貯存前最適宜的干燥處理組合，甜櫻桃花粉含水量與花粉生活力、花粉耐貯存性之間的關(guān)系有待進(jìn)一步設(shè)計(jì)試驗(yàn)探究。

雖然花蕾期花粉生活力顯著低于盛花期[5]，但考慮到花粉純度等方面因素，本試驗(yàn)采集鈴鐺花進(jìn)行花粉樣本收集。本試驗(yàn)在前人研究[11,13,17-18]的基礎(chǔ)上，對(duì)陜西省主栽和示范推廣的5個(gè)品種花粉生活力進(jìn)行了測(cè)定，其結(jié)果與前人研究結(jié)論較為一致。本試驗(yàn)表明以花藥形態(tài)貯存的花粉較以花粉形態(tài)貯存的花粉有更好的耐貯存性，原因可能是花藥的含水量較高的花藥壁具有保護(hù)作用；為提高花粉保存后的生活力，生產(chǎn)中花粉研磨操作規(guī)程有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

果樹(shù)花粉冷凍保存被認(rèn)為是所有研究貯存模式中最有利的一種，前人的研究品種多局限在當(dāng)?shù)刂髟云贩N，本試驗(yàn)探索了陜西省優(yōu)質(zhì)品種花粉的長(zhǎng)期保存，為跨時(shí)間、跨地域的科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供了參考。甜櫻桃花粉對(duì)貯藏條件敏感，室溫不適于甜櫻桃花粉貯存，其貯存時(shí)間不應(yīng)超過(guò)11～13 d。低溫可影響花粉貯存中的活力保持，吉美、艷陽(yáng)、先鋒三種甜櫻桃花粉可在4 ℃條件下進(jìn)行2.5個(gè)月以內(nèi)的短期貯存，但在-20 ℃低溫和-80 ℃超低溫條件下可以實(shí)現(xiàn)周年貯存，且均能保持貯存前40%以上的花粉生活力，可滿足授粉需要，花粉在兩溫度下貯存效果相差不大，考慮到實(shí)際生產(chǎn)條件和成本，建議選擇在-20 ℃低溫條件下對(duì)甜櫻桃花粉進(jìn)行貯存。低溫保存花粉會(huì)出現(xiàn)“冷刺激”效應(yīng)，生活力呈增加趨勢(shì)[19]，本試驗(yàn)低溫貯存中花粉生活力降低可能是在取樣過(guò)程中由于冰箱與室外溫度差導(dǎo)致花粉吸水造成花粉含水量升高，且過(guò)程中未及時(shí)做干燥處理造成的。在生產(chǎn)中應(yīng)選擇可與主栽品種授粉、花粉數(shù)量多、花粉生活力強(qiáng)的品種生產(chǎn)花粉，吉美、艷陽(yáng)、先鋒三個(gè)品種甜櫻桃花粉均適宜作為花粉生產(chǎn)品種，其中以先鋒最為適宜。