頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定四磨湯口服液揮發(fā)性成分

羅飛亞， 唐 其，?， 陳淼芬， 程 辟， 周祎聰， 曹登天， 曾建國，， 楊 華，鄭亞杰?

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸藥湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，湖南長沙 410128；5.湖南漢森制藥股份有限公司，湖南益陽 413000）

四磨湯最早記載于 《重訂嚴(yán)氏濟(jì)生方》，由木香、檳榔、枳殼、烏藥4味藥組成。揮發(fā)油是該中藥制劑發(fā)揮藥效作用的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。在改善胃腸功能低下和促進(jìn)胃腸動力方面發(fā)揮較好的作用[1-4］，臨床上用于嬰幼兒消化不良、老年人腹部脹氣等癥狀[5-7］，在術(shù)后胃腸功能的恢復(fù)方面療效顯著[8-10］。 馬麗等[11］實驗室模擬四磨湯口服液生產(chǎn)工藝，采用水蒸氣蒸餾法獲得揮發(fā)油，并對揮發(fā)油成分進(jìn)行GC-MS檢測，但模擬并不能完全真實反映該制劑在大生產(chǎn)中揮發(fā)性成分的實際情況。劉令安等[12］對大量四磨湯口服液進(jìn)行揮發(fā)油提取，并利用GC-MS對其進(jìn)行分析，但是該方法樣品消耗量大、耗時長。四磨湯口服液現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并未列入揮發(fā)油的相關(guān)檢測項目，尚不能對該制劑進(jìn)行全面有效的質(zhì)量控制。這種情況也存在于2015版 《中國藥典》收錄的多個中藥復(fù)方制劑，如丹紅化瘀口服液、柴胡口服液等[13］。因此開展中藥復(fù)方制劑中揮發(fā)成分的檢測，將極大地促進(jìn)中藥制劑質(zhì)量控制體系的全面提升。

頂空固相微萃取 （HS-SPME）作為一種新興的揮發(fā)性成分萃取和分離技術(shù)，利用膜吸附技術(shù)實現(xiàn)對氣相中揮發(fā)性成分的直接吸附，完全不需要任何萃取溶劑，并能夠最大程度地減少樣品使用量，節(jié)約樣品[14-15］。該技術(shù)與GC-MS聯(lián)用，能夠充分利用GC-MS在揮發(fā)性成分定性分析研究中的高效、靈敏和快速結(jié)構(gòu)解析的特點，同時結(jié)合NIST化合物譜庫檢索，實現(xiàn)復(fù)雜樣品體系中微量揮發(fā)性成分的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)解析。目前該方法已用于川芎、迎春、石韋等植物的揮發(fā)性成分的分析檢測[16-18］，但在中藥復(fù)方制劑揮發(fā)性成分分析中的應(yīng)用尚不多見。

本研究采用HS-SPME-GC-MS方法開展四磨湯口服液中揮發(fā)性成分的分析檢測及其藥味來源的溯源，以期為促進(jìn)四磨湯口服液的全面質(zhì)量研究和提升其質(zhì)量控制水平提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、GC／MS solution色譜工作站和NIST.14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫 （日本島津公司）；固相微萃取裝置、固相微萃取手動進(jìn)樣手柄、萃取纖維頭 （灰色、粉色、白色、藍(lán)色）、頂空樣品瓶 （CNW） （上海安譜實驗科技股份有限公司）；YB-1500A型粉碎機 （永康市速鋒工貿(mào)有限公司）；PL203電子天平 [梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司］；Milli-Q Advantage A10超純水制備系統(tǒng) （美國 MILLPORE公司）。

1.2 藥品與試劑 四磨湯口服液 （批號1709219，10 mL／支），木香、檳榔、烏藥和枳殼藥材，經(jīng)湖南漢森制藥股份有限公司劉愛華高級工程師鑒定為四磨湯口服液生產(chǎn)投料的藥材飲片，均由湖南漢森制藥股份有限公司提供，且經(jīng)質(zhì)量檢驗符合2015年版 《中國藥典》（一部）收錄標(biāo)準(zhǔn)。水為實驗室用Milli-Q超純水系統(tǒng)自制。

2 方法

2.1 固相微萃取樣品前處理 取木香、檳榔、烏藥和枳殼等各單味藥材飲片適量，粉碎后過30目篩，避光陰涼處密封保存。稱取粉碎后的各單味藥材粉末各約7 mg于10 mL頂空樣品瓶中，均勻分布在瓶底，然后加200 μL超純水，放入攪拌子，擰緊瓶蓋，備用。

四磨湯口服液輕搖混勻，去除鋁蓋，吸取口服液0.2 mL于頂空樣品瓶中，放入攪拌子，擰緊瓶蓋，備用。

2.2 萃取纖維頭老化 萃取纖維頭在第1次使用或間隔較長時間使用時需要進(jìn)行老化。將萃取纖維頭裝入萃取進(jìn)樣手柄，然后插入氣相色譜儀的氣化室，設(shè)定氣化室溫度為240℃，推出萃取纖維頭，保持30 min后縮回萃取纖維頭，取出萃取進(jìn)樣手柄。

2.3 萃取過程 將樣品瓶置于帶溫控攪拌功能的固相微萃取裝置上并進(jìn)行固定，先將裝有樣品的頂空樣品瓶在70℃預(yù)熱30 min，再開啟磁力攪拌（400 r／min），然后將萃取進(jìn)樣手柄插入頂空樣品瓶中，推出萃取纖維頭，并確保不與試樣和器壁接觸，使其暴露在樣品上方，保持40 min后縮回萃取纖維頭，取出萃取手柄。

2.4 解吸附過程 將完成萃取過程的萃取進(jìn)樣手柄迅速插入到氣相色譜儀進(jìn)樣口的氣化室內(nèi)，溫度設(shè)定為240℃，推出萃取纖維頭使其暴露在高溫氣化室內(nèi)，熱解析5 min后縮回萃取纖維頭，取出萃取手柄。

2.5 GC-MS條件 CD-WAX色譜柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）；進(jìn)樣口溫度240℃；注入方式無分流；載氣高純He（含有量99.99%）；載氣氣體體積流量0.98 mL／min；程序升溫條件為初始溫度80℃，保持2 min，以4℃／min升至100℃，保持5 min，繼續(xù)以3℃／min升至190℃，保持5 min，再以10℃／min升至240℃，保持5 min，分析檢測時間共計50 min。

離子源為EI源；離子源溫度200℃；接口溫度220℃；電離能量70 eV；m／z 45～500；采集時間50 min。

2.6 揮發(fā)性成分定性 將GC-MS分析獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與計算機NIST.14譜庫進(jìn)行比對分析，綜合參考文獻(xiàn)資料、四磨湯口服液和單味藥材的相關(guān)信息，對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性。

3 結(jié)果與分析

3.1 萃取過程相關(guān)參數(shù)優(yōu)化 為了保證更多揮發(fā)性成分被吸附，并且確保色譜分離過程中色譜峰峰形對稱、分離度高，本研究對萃取纖維頭種類和樣品取樣量進(jìn)行優(yōu)化。

3.1.1 萃取纖維頭選擇 固相微萃取纖維頭的不同顏色代表了不同的吸附膜種類，對揮發(fā)性成分的吸附能力存在較大差異。通過比較對四磨湯口服液中揮發(fā)性成分的吸附能力，篩選出適合四磨湯口服液中揮發(fā)性成分的萃取纖維頭，見圖1。高含有量成分和低含有量成分均呈現(xiàn)出不同的指紋特征。對高含有量揮發(fā)性成分，灰色＞粉色≈藍(lán)色＞白色；對低含有量揮發(fā)成分，灰色＞粉色＞白色＞藍(lán)色；對強保留的高沸點揮發(fā)性成分，粉色＞灰色＞白色＞藍(lán)色。本研究選取吸附揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量相對較多，色譜峰強度高、峰形好且分離效果好的灰色萃取纖維頭用于下一步研究。

圖1 不同顏色萃取纖維頭吸附四磨湯口服液揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 The total ion chromatograms of volatile components from Simotang Oral Solution by different color extraction fiber heads

3.1.2 取樣量優(yōu)化 按照 “2.1”和 “2.3”項下方法，采用稱樣遞減方式，對各單味藥和四磨湯口服液的取樣量進(jìn)行優(yōu)化。以檳榔為例，見圖2，當(dāng)樣品量從0.06 g降到0.007 g時，取樣量約降為原來的10%，但其色譜峰的響應(yīng)值保留了原信號強度的35%，仍然能達(dá)到×106。與此同時檳榔總離子流圖譜中色譜峰峰形對稱，絕大多數(shù)色譜峰分離度能達(dá)到基線分離。采用相同方法，比較了其他單味藥材和四磨湯口服液不同取樣量的GC-MS總離子流圖中色譜峰峰形、色譜強度和色譜峰分離度，選擇它們各自的適宜取樣量，即木香、枳殼、烏藥分別取7 mg，四磨湯口服液取0.2 mL作為本研究使用量。相比于文獻(xiàn) [12］中水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油進(jìn)行檢測，SPME僅需要微量樣品就可以實現(xiàn)復(fù)雜樣品體系中揮發(fā)性成分的分析檢測。

圖2 不同取樣量檳榔中揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of volatile components in Areca with different sampling amounts

3.2 揮發(fā)性成分解析 采用面積歸一化法對各積分色譜峰占總峰面積百分比進(jìn)行計算，再將GCMS獲取的四磨湯口服液中揮發(fā)性成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過NIST.14譜庫檢索和人工仔細(xì)比對，參考文獻(xiàn)報道的四磨湯口服液和單味藥材中揮發(fā)性成分研究結(jié)果，共鑒定了四磨湯口服液27個揮發(fā)性成分中的13個主要揮發(fā)性成分，見表1，其峰面積總和占總峰面積的91.62%。其中占總峰面積百分比超過1%的揮發(fā)性成分包括反式芳樟醇氧化物（呋喃）等峰面積總和占總峰面積的88.95%。作為揮發(fā)性成分的代表組分，可用于四磨湯口服液的進(jìn)一步質(zhì)量研究。

表1 四磨湯口服液中揮發(fā)性成分鑒定及溯源Tab.1 The identification and traceability of volatile components in Simotang Oral Solution

3.3 揮發(fā)性成分藥材溯源 對四磨湯口服液生產(chǎn)投料的單味藥材所含揮發(fā)性成分進(jìn)行HS-SPMEGC-MS分析檢測。同時，通過NIST.14譜庫和文獻(xiàn)對比，對單味藥材的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析鑒定并將結(jié)果與四磨湯口服液中的揮發(fā)性成分進(jìn)行比較，從而對其中揮發(fā)性成分進(jìn)行溯源分析，實現(xiàn)該中藥復(fù)方中揮發(fā)性成分的來源歸屬。

表1可得，芳樟醇在4味藥材中均含有；α-松油醇、 （Z， Z， Z） -9， 12， 15-十八碳三烯-1-醇和百里香酚等來自其中3味藥材；且芳樟醇氧化物、（-）香芹酮和順式香葉醇3種揮發(fā)性組分僅在枳殼揮發(fā)性成分中存在。此外，檳榔和木香2味藥材中均含有的香葉基丙酮在四磨湯口服液中未檢測到，而在四磨湯口服液中的香葉醇和山梨酸在4味單味藥材中均未發(fā)現(xiàn)它們對應(yīng)的揮發(fā)性組分。含有山梨酸可能是由于生產(chǎn)過程中添加的輔料山梨酸鉀在樣品萃取過程中隨水蒸氣蒸發(fā)到頂空樣品瓶氣相部分被吸附所致。

4 討論

目前許多中藥復(fù)方制劑在生產(chǎn)過程中保留了揮發(fā)油或芳香水，但是揮發(fā)性成分檢測在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)方式不盡相同，有的在含有量測定項下，有的在鑒別項下，有的并未進(jìn)行檢測。如 《中國藥典》中收錄的小兒感冒口服液在鑒別項利用薄層色譜法對廣藿香和薄荷中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，并利用氣相色譜法對廣藿香中百秋李醇進(jìn)行含有量測定；藿香正氣口服液的揮發(fā)性性成分僅在鑒別項下檢測紫蘇烯和紫蘇醛；橘紅痰咳液中水蒸氣蒸餾液及薄荷腦，作為揮發(fā)性成分均未在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行控制[13］?，F(xiàn)行的四磨湯口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在含有量測定項下對組方單味藥材相關(guān)的特征指標(biāo)成分 （柚皮苷、辛弗林、去甲異波爾定和檳榔堿）進(jìn)行測定，相比之下作為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一的揮發(fā)油未進(jìn)行質(zhì)量控制[19-20］。因此，本研究通過對四磨湯口服液中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并對其藥材來源進(jìn)行追溯，有利于全面提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，闡明揮發(fā)性成分來源，并為復(fù)方中藥中揮發(fā)性成分檢測及質(zhì)量研究提供參考。

采用HS-SPME-GC-MS方法檢測和鑒定四磨湯口服液中揮發(fā)性成分，經(jīng)樣品量考察發(fā)現(xiàn)該方法靈敏度高。無論固體單味藥材粉末，還是液體樣品，在較少的樣品取樣量的情況下，質(zhì)譜TIC的信號響應(yīng)仍能達(dá)到 （0.9～1.2）×107，完全能夠滿足揮發(fā)性成分的定性分析檢測，很大程度上簡化了樣品的前處理過程，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)方中藥制劑中揮發(fā)油的直接分析檢測，極大地提高了檢測效率。

為了探究研究結(jié)果與文獻(xiàn) [11］存在差異的可能原因，與文獻(xiàn)報道的單味藥材的GC-MS檢測研究結(jié)果進(jìn)行比較[21-24］，結(jié)果表明本研究結(jié)果具有更好的匹配性，而存在差異的原因可能是藥材批次和來源不同、實驗室用藥材與大生產(chǎn)成品用藥材不一致、亦或樣品前處理方法不同等。