油茶枯黃酮類化學(xué)成分及其體外抗炎活性

焦 兵， 許承婷， 黎 青， 覃江克?， 羅勇為， 楊文國

（1.廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，省部共建藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004；2.桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西桂林 541199）

油茶Camellia oleifera Abel.系山茶科山茶屬植物，油茶枯是油茶籽經(jīng)壓榨出油后的固體殘?jiān)?，又名油茶籽餅、茶籽餅粕等，呈紫褐色塊狀，粉碎后即可得到褐色粉末，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的油茶副產(chǎn)品，富含皂素、多糖和黃酮等物質(zhì)[1-4］。每獲得一噸茶油約產(chǎn)生四噸的油茶枯[4］，而工業(yè)上常用于提取皂素，在民間僅用于肥田，大量被廢棄作燃料，未能有效的加以綜合利用和充分發(fā)揮油茶的寶貴價(jià)值，造成了極大的資源浪費(fèi)[5］，因此對(duì)油茶枯綜合利用與開發(fā)研究成為當(dāng)前熱點(diǎn)之一。

研究表明油茶枯中富含黃酮類化合物[6-8］，Chen等[7］運(yùn)用了異丙醇-鹽析預(yù)處理和色譜技術(shù)從油茶籽中分離獲得7個(gè)黃酮苷，并采用ORAC、ABTS抗氧化模型初步評(píng)價(jià)了其體外抗氧化活性。Gao等[4］從油茶枯中分離獲得2個(gè)新黃酮苷和8個(gè)已知山柰酚類化合物，并考察了其對(duì)DPPH自由基的清除活性。劉曉惠[9］對(duì)油茶枯總黃酮的生物活性研究表明，提取的總黃酮具有良好的抗炎活性。油茶枯中黃酮類化合物不僅可以作為優(yōu)良的抗氧化資源，還具有增強(qiáng)人體免疫力、降血壓、抗菌和抗癌等活性，但對(duì)油茶枯中的黃酮，尤其是其中單體化合物的抗炎活性研究很少。為了進(jìn)一步闡明油茶枯抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制，本研究采用柱層析手段對(duì)油茶枯醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇部位化學(xué)成分進(jìn)行分離，并采用現(xiàn)代波譜手段鑒定其結(jié)構(gòu)；采用脂多糖 （LPS）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7建立體外炎癥篩選模型評(píng)價(jià)其抗炎活性，旨在為油茶資源的綜合開發(fā)與利用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 WRS-IA型數(shù)字熔點(diǎn)儀 （上海精密科學(xué)儀器公司）；ESI-MS電噴霧質(zhì)譜儀 （德國布魯克-道爾頓公司）；400 MHz、500 MHz超導(dǎo)核磁共振儀 （瑞士Bruker公司）；P230Ⅱ高效液相色譜 （大連依利特分析儀器有限公司）；Dr.Flash中壓快速純化系統(tǒng) [利穗科技 （蘇州）有限公司］；Infinite M1000型多功能酶標(biāo)儀 （瑞士Tecan公司）；Image Station 4000R凝膠圖像分析系統(tǒng)（kodek公司）；SDS-PAGE電泳儀 （美國 BIORAD公司）；KB-800搖床 （浙江其林貝爾儀器有限公司）；311型 CO2培養(yǎng)箱 （美國 Thermo公司）。

1.2 試劑 油茶枯購于廣西桂林市龍勝縣，經(jīng)廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院唐紹清教授鑒定為正品，粉碎過篩備用。RAW 264.7巨噬細(xì)胞購于中科院上海生命科學(xué)研究院。分析純石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇 （西隴化工股份有限公司）；50 μm ODS常壓開放柱填料 （日本YMC有限責(zé)任公司）。Inertil ODS-3 4.6 i.d.×250 mm ODS分析柱 （日本島津科技公司）；YMC-Pack-ODS-AQ 20.0 i.d.×250 mm ODS制備柱 （日本YMC有限責(zé)任公司）；NO試劑盒 （碧云天公司）；MTT粉劑、DMSO（細(xì)胞級(jí)）、脂多糖 （德國 Sigma公司）；吲哚美辛 [薩恩化學(xué)技術(shù) （上海）有限公司］；ELISA試劑盒 （上海邦奕商貿(mào)有限公司產(chǎn)品）； Rabbit Anti-COX2、 Rabbit Anti-iNOS、 Rabbit Anti-NF-κB （美國 Abcam 公司）；小鼠抗 β-Actin單抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）（中杉金橋公司）。

2 提取與分離

取6 kg油茶枯粉末，用60 L 80%乙醇回流提取3次 （3 h／次），合并提取液，減壓濃縮得褐色流浸膏2.5 L。靜置后撇去上層殘油，將下層浸膏分為10份分別分散于2 L水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。各部分萃取液分別濃縮得石油醚部分500 mL、乙酸乙酯浸膏80 g、正丁醇浸膏275 g。

取乙酸乙酯萃取物80 g，利用硅膠柱層析進(jìn)行分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，收集乙酸乙酯比例為10%、20%、40%、50%、60%的流分；這些組分再利用中低壓制備色譜以50 μm的C18反相硅膠為分離填料，甲醇-水體系按甲醇的比例為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%進(jìn)行梯度洗脫，并根據(jù)HPLC檢測 （5%～100%甲醇-水體系梯度洗脫20 min）的結(jié)果合并相同流份；經(jīng)過中低壓制備色譜分離、合并后的流份，再利用半制備高效液相色譜，按甲醇為85%的甲醇-水體系，檢測波長254 nm的條件進(jìn)行多次反復(fù)分離得到化合物1～3。

取正丁醇萃取物80 g，利用硅膠柱層析進(jìn)行分離，二氯甲烷-甲醇 （100∶0～0∶100） 體系進(jìn)行梯度洗脫。收集甲醇比例為 10%、14%、18%、20%的流分；這些組分再利用中低壓制備色譜以50 μm的C18反相硅膠為分離填料，以10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的甲醇-水梯度洗脫，HPLC檢測 （條件5%～100%，梯度洗脫20 min），合并相同流份。根據(jù)HPLC檢測的結(jié)果合并相同流份；經(jīng)過中低壓制備色譜分離、合并后的流份，再利用半制備高效液相色譜，按甲醇為85%的甲醇-水體系，檢測波長254 nm的條件進(jìn)行多次反復(fù)分離得到化合物4～7。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色無定型粉末，mp 274～276℃。1HNMR （CD3OD，400 MHz） δ： 6.17 （1H，d，J＝2.0 Hz， H-6）， 6.38 （1H， d， J＝2.0 Hz， H-8）， 8.07（2H， d， J＝8.8 Hz， H-2′， 6′）， 6.90 （2H， d， J＝8.9 Hz， H-3′， 5′）；13C-NMR （CD3OD， 100 MHz）δ： 148.0 （C-2）， 137.1 （C-3）， 177.3 （C-4），160.5 （C-5）， 99.2 （C-6）， 162.5 （C-7）， 94.5（C-8）， 158.2 （C-9）， 104.5 （C-10）， 123.7 （C-1′）， 130.7 （ C-2′， 6′）， 165.5 （ C-4′）， 16.3（C-3′，5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) [10]一致，故鑒定為山柰酚。

化合物 2：黃色針狀結(jié)晶，mp252～253℃。1H-NMR （CD3OD， 500MHz） δ： 6.18（1H，d，J＝2.0 Hz， H-6）， 6.38 （1H， d， J＝2.0 Hz， H-8）， 7.73 （2H， d， J＝ 2 Hz， H-2′）， 6.88（1H， d， J＝ 8.5 Hz， H-5′）， 7.63 （1H， dd， J＝2.0， 8.5 Hz， H-6′）；13C-NMR （ CD3OD， 125 MHz） δ： 146.2 （C-2）， 137.2 （C-3）， 177.3（C-4）， 162.5 （C-5）， 99.2 （C-6）， 165.6 （C-7）， 94.0 （C-8）， 158.2 （C-9）， 104.5 （C-10）， 124.1 （C-1′）， 116.2 （C-2′）， 146.2 （C-3′）， 148.8 （C-4′）， 116.0 （C-5′）， 121.8 （C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) [11］一致，故鑒定為槲皮素。

化合物 3：黃色粉末，mp 188～190℃。1HNMR （CD3OD， 400 MHz） δ： 6.22（1H，d，J＝2.4 Hz， H-6）， 6.40 （1H， d， J＝2.4 Hz， H-8）， 7.67（1H， d， J＝2.0 Hz， H-2′）， 6.88 （1H， d， J＝8.4 Hz， H-5′）， 7.63 （1H， dd， J＝ 2.4， 2.4 Hz， H-6′）， 5.11 （1H， d， J＝7.6 Hz， H-1″）， 4.52 （1H，d， J＝1.2 Hz， H-1′?）， 1.12 （3H， d， J＝6.0 Hz， -CH3）；13C-NMR （CD3OD， 100 MHz） δ： 158.5（C-2）， 135.6 （C-3）， 179.4 （C-4）， 161.0 （C-5）， 99.9 （C-6）， 166.0 （C-7）， 94.9 （C-8），159.4 （C-9）， 105.7 （C-10）， 123.2 （C-1′），116.1 （ C-2′）， 149.8 （ C-3′）， 145.9 （ C-4′），117.7 （ C-5′）， 123.6 （C-6′）， 102.4 （Glc-1），5.7 （Glc-2）， 78.2 （Glc-3）， 71.4 （Glc-4），77.3 （Glc-5）， 68.6 （Glc-6）， 104.7 （Rha-1），72.1 （Rha-2）， 72.3 （Rha-3）， 73.9 （Rha-4），69.7 （Rha-5）， 17.9 （Rha-6）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12］一致，故鑒定為蘆丁。

化合物 4：黃色無定型粉末，mp 223～224℃。1H-NMR （CD3OD， 500MHz） δ： 8.08（2H， d， J＝7.2 Hz， H-2′， 6′）， 6.89 （2H， d， J＝7.2 Hz， H-3′， 5′）， 6.39 （1H， d， J＝1.2 Hz， H-8）， 6.19 （1H， d， J＝1.6 Hz， H-6）， 5.46 （1H，d， J＝ 6 Hz， H-1″）， 4.75 （1H， d， J＝ 5.4 Hz， H-1?）， 3.21-3.94 （9H， m， H-2″， 2?， 3″， 3?， 4″，4?， 5″， 5?， 6?）；13C-NMR （CD3OD， 125 MHz）δ： 158.5 （C-2）， 135.0 （C-3）， 179.6 （C-4），163.1 （C-5）， 99.8 （C-6）， 165.9 （C-7），94.6 （C-8）， 158.4 （C-9）， 105.8 （C-10），122.8 （ C-1′）， 132.3 （ C-2′， 6′）， 116.2 （ C-3′， 5′）， 161.5 （C-4′）， 100.8 （Ara-1）， 82.5（Ara-2）， 75.0 （Ara-3）， 71.1 （Ara-4）， 66.7（Ara-5）， 105.5 （Glc-1）， 77.1 （Glc-2）， 78.4（Glc-3）， 71.0 （Glc-4）， 78.2 （Glc-5）， 62.4（Glc-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) [13］一致，故鑒定為山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖 （1→2） -α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物5：淡黃色結(jié)晶型粉末，mp 208.2～209.4 ℃。1H-NMR （CD3OD， 400 MHz） δ： 8.06（2H， d， J＝8.8 Hz， H-2′， 6′）， 6.89 （2H， d， J＝8.8 Hz， H-3′， 5′）， 6.40 （1H， d， J＝ 1.6 Hz， H-8），6.21 （1H， d， J＝1.6 Hz， H-6）， 5.13 （1H，d， J ＝ 7.6 Hz， H-1″）， 4.52 （ 1H， s， H-1?），3.23-3.82 （10H， m， H-2″， 2?， 3″， 3?， 4″， 4?，5″， 5?， 6″）；13C-NMR （ CD3OD， 100 MHz） δ：158.5 （C-2）， 135.5 （C-3）， 179.4 （C-4），163.0 （C-5）， 100.0 （C-6）， 166.0 （C-7）， 94.9（C-8）， 159.4 （C-9）， 105.7 （C-10）， 122.8 （C-1′）， 132.4 （ C-2′）， 116.1 （ C-3′）， 161.5 （ C-4′）， 116.1 （C-5′）， 132.4 （C-6′）， 102.4 （Glc-1）， 75.8 （Glc-2）， 78.1 （Glc-3）， 73.9 （Glc-4），77.2 （Glc-5）， 68.6 （Glc-6）， 104.6 （Rha-1），72.1 （Rha-2）， 72.3 （Rha-3）， 71.4 （Rha-4），69.7 （Rha-5）， 17.9 （Rha-6）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4，14]一致， 故鑒定山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖-（1→6） -β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物 6：黃色無定型粉末，mp194～195 ℃。1H-NMR （500 MHz， DMSO-d6） δ： 8.02 （d，J＝8.6 Hz， 2H， H-2′， H-6′）， 6.88 （d， J＝8.4 Hz，2H， H-3′， H-5′）， 6.41 （s， 1H， H-8）， 6.19 （s，1H，H-6）， 5.56 （d， J＝7.2 Hz， 1H， Glu H-1），4.57 （d， J＝7.2 Hz， 1H， Xyl H-1）， 4.33 （s， 1H，Rha H-1）， 3.7-3.06 （m， 15H）， 0.94 （d， J＝5.6 Hz， 3H， Rha H-6）；13C-NMR （125 MHz，DMSO-d6） δ： 177.9 （C-4）， 164.4 （C-7）， 161.7（C-5）， 160.3 （C-4′）， 156.8 （C-2）， 156.3 （C-9），133.3 （C-3）， 131.4 （C-2′， 6′）， 121.4 （C-1′），115.6 （C-3′， 5′）， 104.9 （C-10）， 104.4 （Rha C-1）， 100.9 （Xyl C-1）， 99.1 （Glu C-1）， 98.6 （C-6），94.1 （C-8），82.1 （Glu C-2），77.2 （Glu C-3），76.5 （Glu C-5）， 76.2 （Xyl C-3）， 74.2 （Xyl C-2），72.3 （Rha C-3）， 71.0 （Rha C-2）， 70.8 （Rha C-4）， 71.4 （Xyl C-4）， 69.9 （Glu C-4）， 68.6 （Rha C-5）， 66.5 （Glu C-6），66.1 （Xyl C-5），18.1 （Rha C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) [15］一致，故鑒定為山柰酚-3-O- [2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷。

化合物7：黃色無定型粉末，mp 202～204℃。1HNMR （500 MHz， DMSO-d6） δ： 7.98 （d， J＝ 8.6 Hz， 2H， H-2′， 6′）， 6.89 （d， J＝ 8.7 Hz， 2H， H-3′， 5′）， 6.40 （s， 1H， H-8）， 6.19 （d， J＝1.6 Hz，1H，H-6）， 5.53 （d， J＝5.4 Hz， 1H， Glu H-1），4.58 （d， J＝7.8 Hz， 1H， Gal H-1）， 4.30 （s， 1H，Rha H-1）， 0.93 （d， J＝ 6.1 Hz， 3H， Rha H-6）；13C-NMR （125 MHz， DMSO-d6） δ： 177.9 （C-4），164.6 （C-7）， 161.7 （C-5）， 160.3 （C-4′）， 156.9（C-9）， 156.8 （C-2）， 133.2 （C-3）， 131.2 （C-2′，6′）， 121.4 （C-1′）， 115.7 （C-3′， 5′）， 104.5 （C-10）， 104.3 （Gal C-1）， 100.8 （Rha C-1）， 99.2（Glu C-1），98.7（C-6），94.2（C-8），82.7（Glu C-2）， 77.5 （Glu C-3）， 77.0 （Glu C-5）， 76.9 （Gal C-5），76.1 （Gal C-3），74.8 （Gal C-2），72.3 （Rha C-3）， 71.0 （Rha C-2）， 70.8 （Glu C-4）， 70.1（Rha C-4）， 70.0 （Gal C-4）， 68.6 （Rha C-5），66.4 （Glu C-6），61.3 （Gal C-6），18.1 （Rha C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) [15］一致，故鑒定為山柰酚-3-O- [2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷。

所有化合物均為黃酮類化合物，其中化合物4為首次從該植物中分離得到?？紤]到化合物2～3的抗炎活性研究已有較多報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)選取化合物1、4～7進(jìn)行抗炎活性研究。

4 方法與結(jié)果

4.1 抗炎活性測試

4.1.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將生長態(tài)勢表現(xiàn)良好的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行消化，吹打均勻得細(xì)胞懸液。按照 180 μL／孔的體積將濃度為 1×105個(gè)／mL 的RAW264.7細(xì)胞懸液接種于 96孔板中，于5%CO2、37℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后棄去培養(yǎng)基，重新加入新鮮的培養(yǎng)基180 μL，并在每孔中加入10 μL的LPS溶液使其質(zhì)量濃度為5 ng／mL，刺激2 h后將吲哚美辛或所得黃酮類化合物樣品，加入96孔板中，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于含5%CO2、37℃、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL 5 mg／mL的MTT溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后棄掉上清液，每孔加入DMSO 100 μL并震蕩使甲臜紫色結(jié)晶完全溶解，于酶標(biāo)儀中，選擇波長為570 nm，測定光密度值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

4.1.2 NO抑制率 采用Griess法檢測亞硝酸鹽，從而測定出總NO的含有量。取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行消化，按每孔2 mL接種至6孔培養(yǎng)板，于含5%CO2、37℃、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸盡每孔上清液，加入新鮮DMEM培養(yǎng)基，分為對(duì)照組、LPS（5 ng／mL）組、LPS（5 ng／mL）+化合物組，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度藥物后于5%CO2、37℃、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后取細(xì)胞上清液測定其中NO的含有量。

4.1.3 PGE2抑制率 采用ELISA雙抗體夾心法來測定PGE2。實(shí)驗(yàn)步驟同 “4.1.2”項(xiàng)，取上清液根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定并計(jì)算細(xì)胞上清液中PGE2濃度。

4.1.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行消化、接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿，于含5%CO2、37℃、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去上清液，加入新鮮DMEM培養(yǎng)基，分為對(duì)照組、 LPS（5 ng／mL） 組、 LPS（5 ng／mL） +化合物組，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后提取細(xì)胞總蛋白。用碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組取等量蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE），將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液室溫封閉2 h后結(jié)合一抗，4℃孵育過夜，次日與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合，搖床中室溫孵育1.5 h。經(jīng)顯影、定影后，用掃描儀和凝膠成像系統(tǒng)記錄相應(yīng)條帶的透射光積分光密度值，以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參，檢測蛋白表達(dá)量。

4.2 結(jié)果

4.2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 采用MTT方法測定了陽性對(duì)照吲哚美辛以及山柰酚類化合物1、4～7對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7存活率的影響，見圖1。吲哚美辛及化合物 1、 4～7在濃度為 100 μmol／L時(shí)，細(xì)胞存活率均大于85%，與陰性對(duì)照組無明顯差異，表明吲哚美辛和化合物1、4～7在該濃度值下無明顯細(xì)胞毒作用。

圖1 LPS、吲哚美辛及化合物1、4～7對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of LPS， indometacin and compounds 1，4-7 on the cell viability of RAW 264.7

4.2.2 抗炎活性

4.2.2.1 對(duì)NO的抑制作用 化合物1、4～7對(duì)NO的抑制能力測定結(jié)果見圖2，NO在正常組細(xì)胞中存在少量基礎(chǔ)表達(dá)，當(dāng)RAW 264.7受到LPS誘導(dǎo)后大量表達(dá) NO，NO水平較空白組提升至56.31 μmol／L （P＜0.01）。 當(dāng)加入抗炎藥物吲哚美辛做陽性對(duì)照時(shí)，細(xì)胞上清液中NO水平顯著降低（P＜0.01）；在測試組中，所測試的這些化合物均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO表達(dá) （P＜0.01），且表現(xiàn)出較好的劑量依賴性。

圖2 化合物1、4～7對(duì)NO表達(dá)水平的影響Fig.2 Effects of compounds 1，4-7 on the level of NO expression

4.2.2.2 對(duì)PGE2的抑制作用 化合物1、4～7對(duì)PGE2的抑制能力測定結(jié)果，見圖3。PGE2在正常組細(xì)胞中存在少量基礎(chǔ)表達(dá)。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5 ng／mL的LPS刺激2 h后，PGE2水平顯著提升（P＜0.01）， 達(dá) 106.5 pg／mL。 當(dāng)加入抗炎藥物吲哚美辛和化合物1、4～7均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的PGE2表達(dá) （P＜0.01），其中化合物1在濃度為100 μmol／L時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)的PGE2的抑制效果最佳，此時(shí)細(xì)胞上清中的PGE2的含有量為41.4 pg／mL，且山柰酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的PGE2的抑制作用均優(yōu)于其苷類化合物。

圖3 化合物1、4～7對(duì)PGE2表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of compounds 1，4-7 on the level of PGE2 expression

4.2.2.3 對(duì)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的抑制作用圖4～5表明，在RAW264.7細(xì)胞中，無刺激時(shí)，細(xì)胞中iNOS、COX-2的表達(dá)量較低；LPS刺激能夠引起iNOS、COX-2蛋白表達(dá)水平顯著提高；加入山柰酚類化合物以后，細(xì)胞中iNOS、COX-2的表達(dá)量顯著降低，隨著化合物的濃度增大其作用效果增強(qiáng)。結(jié)果表明化合物1、4～7能夠很好的抑制LPS引起的iNOS、COX-2的表達(dá)，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。在化合物 1、4～7中，山柰酚本身對(duì)iNOS、COX-2蛋白的抑制能力最好，隨著3位羥基被取代其活性逐漸變?nèi)酢?/p>

圖4 化合物1、4～7對(duì)iNOS的抑制作用Fig.4 Effects of compounds 1，4-7 on the inhibition to iNOs

圖5 化合物1、4～7對(duì)COX-2的抑制作用Fig.5 Effects of compounds 1，4-7 on the inhibition to COX-2

4.2.2.4 化合物1、4～7對(duì)NF-κB相關(guān)蛋白P65的抑制作用 在細(xì)胞中NF-κB通常以失活狀態(tài)存在，但當(dāng)細(xì)胞暴露于外來刺激如有絲分裂原、炎性細(xì)胞因子、LPS時(shí)會(huì)引起IKK復(fù)合體快速將IκB磷酸化繼而泛素化，隨后被相應(yīng)蛋白酶降解，此時(shí)NF-κB結(jié)構(gòu)中的核定位信號(hào)被暴露，進(jìn)而激活促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等靶基因的轉(zhuǎn)錄過程，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)己證明NF-κB可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌炎性因子的水平[16］。圖6表明，LPS刺激能夠引起NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著提高；加入化合物1、4～7后，細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)量顯著降低，隨著化合物的濃度增大其作用效果增強(qiáng)，呈現(xiàn)出劑量依賴性。結(jié)果表明化合物1、4～7能夠很好的抑制LPS引起的NF-κB的表達(dá)；并且山柰酚本身對(duì) NF-κB蛋白的抑制能力較其苷類更佳，隨著3位羥基被取代其活性減弱。

圖6 化合物1、4～7對(duì)NF-κB相關(guān)蛋白P65的抑制作用Fig.6 Effects of compounds 1， 4-7 on the inhibition to P65 of NF-κB

5 結(jié)論

核轉(zhuǎn)錄因子 （NF-κB）可調(diào)節(jié)控制細(xì)胞增殖或生長、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞粘附等基因的表達(dá)，能夠與B細(xì)胞免疫球蛋白κ輕鏈的增強(qiáng)子序列發(fā)生相互作用，是轉(zhuǎn)錄激活過程中實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子之一[17］。由于NF-κB能誘導(dǎo)包括許多炎癥反應(yīng)和腫瘤相關(guān)基因 [如環(huán)氧合酶-2（COX-2）基因、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶 （iNOS）基因、基質(zhì)金屬蛋白酶 （NMP-9）、抗凋亡基因、促炎分子基因等］的表達(dá)，而導(dǎo)致炎癥或腫瘤的發(fā)生，從而成為醫(yī)藥領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)有效抗炎、抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)[18-19］。

本研究采用植物化學(xué)和波譜學(xué)相結(jié)合的技術(shù)，從油茶枯乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇部位分離并鑒定了7個(gè)黃酮類化合物，其中化合物1、4～7為山柰酚類化合物。化合物4為首次從該植物中分離得到。隨后建立脂多糖 （LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生炎癥的細(xì)胞篩選模型，結(jié)果表明化合物1、4～7均可顯著抑制NO、PGE2在細(xì)胞內(nèi)的濃度；能抑制RAW 264.7細(xì)胞中NF-κB的活性，以及下調(diào)誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶 （iNOS）和環(huán)氧合酶-2（COX-2）的表達(dá)。其可作為炎癥介質(zhì)或因子的抑制劑而抗炎藥物的開發(fā)上具有良好發(fā)展前景。