趕黃草3種提取物對(duì)小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的保護(hù)作用

范 玲， 謝星星， 陳 立， 王璐璐， 黃力強(qiáng)， 趙飄飄， 熊玉霞?

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000）

內(nèi)毒素是G-桿菌生長(zhǎng)時(shí)釋放或死亡時(shí)裂解出來(lái)的細(xì)胞壁成分，被公認(rèn)是導(dǎo)致膿毒癥、嚴(yán)重休克、多臟器功能衰竭的主要致病因子[1］。肝臟既是清除內(nèi)毒素的主要場(chǎng)所，也是內(nèi)毒素血癥受損最早、最明顯的靶器官之一[2］，肝損傷后對(duì)該因子的清除功能減退，輕者出現(xiàn)乏力、精神不佳、食欲不振等亞健康癥狀，嚴(yán)重者大量?jī)?nèi)毒素在肝臟未經(jīng)解毒就溢入人體循環(huán)，引起內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而導(dǎo)致呼吸、神經(jīng)、循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)等損害，甚至致死性感染性休克、多器官功能衰竭[3-4］。目前，內(nèi)毒素性肝損傷的治療措施機(jī)制比較單一，大多忽略膽紅素升高造成的繼發(fā)性肝損傷，而且未涉及自身免疫調(diào)控，綜合治療力度明顯不足，但采取多種藥物聯(lián)合使用必然會(huì)增加肝臟負(fù)荷，增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，故開(kāi)發(fā)廉價(jià)、毒副作用小、增強(qiáng)機(jī)體自身免疫調(diào)控、藥效良好的天然藥物成為治療內(nèi)毒素性肝損傷的重要任務(wù)。

趕黃草學(xué)名扯根菜，為虎耳草科扯根菜屬植物[5］，主要分布于我國(guó)四川、云南、貴州等地，人工栽培品以四川省瀘州古藺為道地產(chǎn)區(qū)，民間歷來(lái)作為藥食兩用植物[6］，其最主要藥理作用為保肝，對(duì)各種原因引起的肝損傷具有保護(hù)作用[7］，以趕黃草為原料制備的肝蘇顆粒在臨床上已得到廣泛應(yīng)用，但目前尚無(wú)將其用于治療內(nèi)毒素性肝損傷的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)探討趕黃草在體外對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化和體內(nèi)內(nèi)毒素致小鼠肝損傷的影響，為該植物應(yīng)用于臨床相關(guān)疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 趕黃草 （產(chǎn)地四川，批號(hào)150204-1）購(gòu)自瀘州百草堂中藥飲片公司，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)中藥教研室孫琴教授鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物趕黃草Penthorum chinense Pursh的全草。肝蘇顆粒購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院。脂多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒購(gòu)自北京安迪華泰生物科技有限公司；兔抗大鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）、山羊抗大鼠凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）購(gòu)自北京Santa公司；TRITC標(biāo)記兔抗山羊二抗、FITC標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （AST）、超氧物歧化酶（SOD）、丙二醛 （MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；高速低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本Sanyo公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司；EVOS FL無(wú)目鏡熒光倒置顯微鏡購(gòu)自美國(guó)AMG公司。

1.3 細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供，在5%CO2、37℃條件下用含10%Gibco胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2013-065。小鼠在恒溫、光照周期12 h／12 h環(huán)境中飼養(yǎng)1周后建立內(nèi)毒素性肝損傷模型，實(shí)驗(yàn)前24 h禁食不禁水。

2 方法

2.1 提取物制備 精密稱取粉碎趕黃草3份，分別用水、70%乙醇、95%乙醇按料液比1∶10在85℃下水浴回流提取3次，分別合并3次提取液過(guò)濾后蒸發(fā)掉大部分溶劑，收集提取液，濃縮后40℃烘干至恒定質(zhì)量，即得3種對(duì)應(yīng)提取物。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 藥液配制 提取物用DMSO溶解后經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，-20℃下保存。實(shí)驗(yàn)前，用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，DMSO終濃度小于0.1%。

2.2.2 安全濃度測(cè)定 采用MTS法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105／mL后接種于96孔板中，每孔100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h，吸除舊培養(yǎng)液，分別加入含3種提取物的培養(yǎng)基 （400、 200、 100、 50、 25、 12.5、6.25 mg／L），空白組加含 DMSO 0.1%的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入10 μL MTS溶液，培養(yǎng)2 h后在495 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2.2.3 細(xì)胞分組 根據(jù)安全濃度測(cè)試結(jié)果，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組（0.5 mg／L總多糖），及提取物高、中、低劑量組 （分別用含0.5 mg／L LPS的 DMEM 培養(yǎng)液配制成 50、25、12.5 mg／L）。

2.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 調(diào)整細(xì)胞密度為1×106／mL后接種于24孔板，每孔600 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，吸除舊培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞分組處理12 h，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，棄去培養(yǎng)基，PBS潤(rùn)洗3次后4%多聚甲醛固定10 min，按照Giemsa試劑盒操作步驟染色，倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。

2.2.5 細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β水平檢測(cè) 采用ELISA法。調(diào)整細(xì)胞密度為2×105／mL后接種于96孔板中，每孔100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸除舊培養(yǎng)液，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法分組 （根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)TNF-α、IL-1β時(shí)分別處理6、16 h），取培養(yǎng)上清，離心去除細(xì)胞沉淀，按照 ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè) TNF-α、IL-1β水平。

2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 分組、造模及給藥 小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、肝蘇顆粒組及提取物組，每組12只，除空白組外各組小鼠尾靜脈注射脂多糖 （4 mg／kg）以建立內(nèi)毒素致肝損傷模型，肝蘇顆粒組和提取物組在造模前 12 h、造模后 2 h分別灌胃藥液（1 mg／mL）。

2.3.2 肝臟組織學(xué)檢查 脂多糖注射后12 h，小鼠腹主動(dòng)脈取血1.5 mL，迅速切取新鮮肝左葉組織2小塊，置于10%中性福爾馬林磷酸鹽緩沖液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)改變。

2.3.3 血漿AST、ALT水平檢測(cè) 小鼠腹主動(dòng)脈取血1.5 mL后，4℃、4 000 r／min下離心10 min，吸取上層血清，立即放入EP管中，-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ缓?，按照相?yīng)試劑盒操作步驟檢測(cè)ALT、AST水平。

2.3.4 肝組織SOD、MDA水平檢測(cè) 取小鼠肝臟同一部位組織，準(zhǔn)確稱量約0.5 g，制備肝勻漿液。然后，按照相應(yīng)試劑盒操作步驟檢測(cè)SOD、MDA水平。

2.3.5 肝組織ASC、NLRP3表達(dá)檢測(cè) 采用免疫熒光法。取小鼠肝組織切片，65℃下烘片2 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，3%H2O2除去內(nèi)源性酶。將切片置于枸櫞酸溶液中高溫修復(fù)，自然冷卻至室溫，滴加0.3%TritonX-100打孔，5%BSA封閉，滴加一抗，4℃下過(guò)夜，次日復(fù)溫，滴加熒光二抗，37℃下避光孵育，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察比較并拍照。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞活力 根據(jù) 《美國(guó)藥典》中細(xì)胞相對(duì)增值率與細(xì)胞毒性分級(jí)的關(guān)系，當(dāng)水提取物、70%乙醇提取物、95%乙醇提取物質(zhì)量濃度分別在6.25～400、 6.25～100、 6.25～25 mg／L 范圍內(nèi)時(shí)細(xì)胞毒性分級(jí)≤1級(jí)，可相應(yīng)在此質(zhì)量濃度及以下進(jìn)行后續(xù)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 提取物對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of extracts on cell viability

3.2 細(xì)胞形態(tài) 未經(jīng)脂多糖刺激的細(xì)胞呈圓形，抱團(tuán)生長(zhǎng)，突起較少，邊界清楚；脂多糖刺激后細(xì)胞出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象明顯減少，偽足增加、胞體膨大、細(xì)胞邊緣不清、形態(tài)不規(guī)則等活化現(xiàn)象；與模型組比較，70%乙醇提取物組 （25、50 mg／L）細(xì)胞偽足明顯減少，胞體體積減小，細(xì)胞邊緣較清楚，形態(tài)大體呈圓形，但仍未達(dá)到脂多糖刺激前狀態(tài)。見(jiàn)圖2。3.3 細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β水平 與空白組比較，模型組 TNF-α、IL-1β水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，水提取物組、70%乙醇提取物兩者水平降低，以后者更顯著 （P＜0.05，P＜0.01）。 見(jiàn)圖 3。

圖2 提取物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 （Giemsa，×400）Fig.2 Effects of extracts on cell morphology （Giemsa， ×400）

圖3 提取物對(duì)TNF-α （a）、IL-1β （b） 水平的影響Fig.3 Effects of extracts on TNF-α （a） and IL-1β （b） levels

3.4 小鼠肝組織病理學(xué)變化 空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，未見(jiàn)變性和壞死；模型組小鼠肝小葉匯管區(qū)內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，中性粒細(xì)胞增多，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死及小灶性壞死，有的呈氣球樣變化，肝細(xì)胞間質(zhì)見(jiàn)大量充血；與模型組比較，肝蘇顆粒組和70%乙醇提取物組炎細(xì)胞浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少，肝細(xì)胞輕度濁腫，未見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死。見(jiàn)圖4。

圖4 小鼠肝組織病理學(xué)變化Fig.4 Pathological changes of mouse liver tissue

3.5 血漿AST、ALT水平 與空白組比較，模型組ALT、AST水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，70%乙醇提取物組兩者水平顯著降低 （P＜0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 提取物對(duì)ALT、AST水平的影響 （）Tab.1 Effects of extracts on ALT and AST levels（

表1 提取物對(duì)ALT、AST水平的影響 （）Tab.1 Effects of extracts on ALT and AST levels（

注：空白組、95%乙醇提取物組各有2只小鼠死亡，模型組、水提取物組、70%乙醇提取物組各有1只小鼠死亡。與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 脂多糖／（mg·kg-1） 動(dòng)物數(shù)／只 AST／（U·L-1） ALT／（U·L-1）空白組 — 10 62.76±6.94 36.15±6.41模型組 4 11 214.10±26.84?? 221.09±29.30??肝蘇顆粒組 4 12 100.24±21.45?# 99.87±30.54?#水提取物組 4 11 193.82±14.05?? 98.65±21.58??#70%乙醇提取物組 4 11 144.37±14.01?# 74.46±12.17#95%乙醇提取物組 4 10 217.97±7.81?? 145.98±24.2??

3.6 肝組織SOD、MDA水平 與空白組比較，模型組MDA水平顯著上升 （P＜0.05）；與模型組比較，70%乙醇提取物組MDA水平顯著降低 （P＜0.05），同時(shí)各組 SOD水平均無(wú)顯著變化 （P＞0.05）。 見(jiàn)表 2。

3.7 肝組織ASC、NLRP3表達(dá) 空白組小鼠肝臟中ASC、NLRP3幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá)；模型組小鼠肝臟中兩者表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且具有共定位性；肝蘇顆粒組和70%乙醇提取物組能明顯降低兩者表達(dá)。見(jiàn)圖5。

表2 提取物對(duì)SOD、MDA水平的影響 （）Tab.2 Effects of extracts on SOD and MDA levels（

表2 提取物對(duì)SOD、MDA水平的影響 （）Tab.2 Effects of extracts on SOD and MDA levels（

注：空白組、水提取物組各有2只小鼠死亡，模型組、70%乙醇提取物組各有1只小鼠死亡。與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 脂多糖／（mg·kg-1） 動(dòng)物數(shù)／只 SOD／[U·（mg prot）-1］ MDA／[nmol·（mg prot）-1］空白組 — 10 135.37±12.09 3.16±0.69模型組 4 11 119.49±19.93 5.48±1.37?肝蘇顆粒組 4 12 132.60±13.5 3.79±0.87#水提取物組 4 10 147.57±20.64 4.85±1.26??70%乙醇提取物組 4 11 137.77±23.6 3.99±0.95#95% 乙醇提取物組 4 12 133.34±22.34 5.48±0.53??

圖5 各組ASC、NLRP3表達(dá)Fig.5 ASC and NLRP3 expressions in various groups

4 討論

趕黃草在苗族民間用于治療肝病，據(jù) 《中藥大辭典》[8］和 《四川中藥志》[9］記載， 其具有清熱解毒、活血散瘀、利水消腫、退黃、平肝的功效。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，趕黃草70%乙醇提取物可明顯降低脂多糖致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平，改善肝臟組織病理變化，提示它可減輕肝細(xì)胞損傷，改善肝臟功能。

內(nèi)毒素性肝損傷的原理是單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞在外界刺激作用下向肝臟積聚并致敏，致敏的巨噬細(xì)胞接觸到脂多糖后會(huì)釋放一些炎性介質(zhì) （如自由基、IL-1β和TNF-α等），繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，并造成肝細(xì)胞損傷[10］。在內(nèi)毒素性肝損傷中，TNF-α是最關(guān)鍵的細(xì)胞因子之一，可與肝星形細(xì)胞緊密結(jié)合，釋放多種炎性介質(zhì)，形成瀑布效應(yīng)，也可吸引中性粒細(xì)胞進(jìn)入肝內(nèi)，并產(chǎn)生蛋白酶及超氧陰離子，多種炎性介質(zhì)共同構(gòu)成炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起肝臟壞死性損傷[11-12］。IL-1β細(xì)胞活性依賴于釋放細(xì)胞因子水平，當(dāng)其水平較低時(shí)，主要生物學(xué)效應(yīng)是引起組織局部炎癥反應(yīng)，同時(shí)也可特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)IL-6合成[13］；但當(dāng)IL-1β大量產(chǎn)生時(shí)，它可進(jìn)入血流并引發(fā)機(jī)體發(fā)熱效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，趕黃草70%乙醇提取物可顯著降低 RAW264.7細(xì)胞上清 TNF-α、IL-1β水平，可能是趕黃草保護(hù)內(nèi)毒素性肝損傷的重要因素之一。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生內(nèi)毒素血癥時(shí)，脂多糖誘導(dǎo)固有免疫細(xì)胞激活，也是加重肝細(xì)胞損傷的重要因素[14］。NLRP3炎性復(fù)合體是固有免疫的重要組成部分，主要存在于細(xì)胞內(nèi)，是目前研究最廣泛的NLR家族成員[15］，其小體活化的共同上游機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)K+外流、溶酶體破裂、活性氧 （ROS） 產(chǎn)生[16］。脂質(zhì)損傷的發(fā)生常伴隨著 ROS生成，而MDA是反應(yīng)膜脂過(guò)氧化損傷的重要指標(biāo)之一[11］，故脂多糖致肝損傷中膜脂過(guò)氧化損傷引起ROS釋放增加是激活NLRP3的主要途徑之一。NLRP3是一種復(fù)合體支架，當(dāng)內(nèi)外源性刺激因素作用于其受體時(shí)，它將進(jìn)行低聚化，進(jìn)而招募pro-caspase-1和ASC形成NLRP3炎性小體，后者進(jìn)一步激活Caspase-1，活化后的Caspase-1對(duì)前體IL-1β進(jìn)行剪切，促進(jìn)后者成熟和分泌[17］，故對(duì)NLRP3炎性小體的調(diào)控也是治療LPS性肝損傷的一個(gè)重要手段。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組肝組織MDA水平明顯增加，表明肝細(xì)胞膜脂過(guò)氧化損傷嚴(yán)重，病理切片顯示大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞壞死；趕黃草70%乙醇提取物可顯著改善上述現(xiàn)象，同時(shí)免疫熒光顯示它可明顯降低脂多糖致肝組織ASC、NLRP3表達(dá)。因此，趕黃草70%乙醇提取物對(duì)小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的保護(hù)作用可能與減少TNF-α產(chǎn)生、調(diào)控ROS／NLRP3／IL-1β通路有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步確認(rèn)。