硬枝黃蟬提取物對(duì)胡椒瘟病病菌的抑菌活性及抑菌活性成分分離

茍亞峰，胡林峰，陳世敏，楊賀賀，孫世偉

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南萬(wàn)寧 571533；2.河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

硬枝黃蟬（Allemanda neriifolia Hook.）是夾竹桃科（Apocynaceae）黃蟬屬（Allemanda）植物，為常綠灌木植物，原產(chǎn)于巴西，在我國(guó)亞熱帶地區(qū)的廣東、福建、廣西、臺(tái)灣等地有引種，現(xiàn)廣泛栽培于熱帶地區(qū)，是一種觀賞植物［1］。夾竹桃科植物一般有毒，含有多種類(lèi)型的生物堿，如夾竹桃苷、蘿芙木堿、長(zhǎng)春花堿、軟枝黃蟬苷等，是重要的藥物原料，可治療多種疾病，在農(nóng)業(yè)上用于殺蟲(chóng)防治。林同等研究發(fā)現(xiàn)，硬枝黃蟬花的乙醇提取物對(duì)白蟻具有一定的防治效果［2］；馮崗等研究發(fā)現(xiàn)，軟枝黃蟬提取物對(duì)螺旋粉虱成蟲(chóng)、椰心葉甲具有一定的毒殺活性［3-4］，但關(guān)于其抑菌活性的報(bào)道較少。筆者前期對(duì)豐富的熱帶植物抑菌活性進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，硬枝黃蟬具有較強(qiáng)的抑菌活性，但對(duì)具體的抑菌活性成分未進(jìn)行分離。因此，本試驗(yàn)以威脅胡椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害胡椒瘟病病菌為供試病原菌，研究硬枝黃蟬無(wú)水乙醇提取物的萃取組分及其餾分的抑菌活性，以期為進(jìn)一步分離硬枝黃蟬的抑菌活性物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌 胡椒瘟病病菌（Phytophthora capsici）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供，桑利偉等對(duì)海南省主產(chǎn)區(qū)胡椒瘟病病原進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，胡椒瘟病由辣椒疫霉（Phytophthora capsici）引起［5］。

1.1.2 供試植物 供試植物硬枝黃蟬全株采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所內(nèi)及萬(wàn)寧市文通村內(nèi)。

1.2 硬枝黃蟬無(wú)水乙醇提取物的制備

供試植物硬枝黃蟬樣品前處理和提取均參照馮俊濤等的方法［6］，得到無(wú)水乙醇提取物浸膏后，于冰箱中（0～4℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 硬枝黃蟬提取物不同萃取物的制備

采用液-液萃取法，具體參照筆者之前報(bào)道的操作方法［7］進(jìn)行，分別得硬枝黃蟬乙醇提取物石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分浸膏，備用。

1.4 抑菌活性測(cè)定方法

采用菌絲生長(zhǎng)速率法［8-9］。具體方法如下：稱(chēng)取0.2 g硬枝黃蟬無(wú)水乙醇提取物浸膏，用無(wú)菌蒸餾水定容至20 mL，制成濃度為10 mg/mL的無(wú)水乙醇提取物母液。再用無(wú)菌蒸餾水稀釋制成濃度為5 mg/mL的無(wú)水乙醇提取物。然后將培養(yǎng)基融化并冷卻至50℃左右，將4 mL不同濃度的硬枝黃蟬無(wú)水乙醇提取物分別與36 mL/瓶的PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基混合，搖勻后迅速將其倒入3個(gè)直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中。待其凝固后，取菌落直徑為6 mm、培養(yǎng)好的各供試病原菌的外層菌塊置于培養(yǎng)皿中央，以加入等體積滅菌水的PDA培養(yǎng)平板為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3皿重復(fù)。接種后，在人工氣候培養(yǎng)箱（溫度為25～28℃）中培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法分別測(cè)量菌落直徑（cm），求其平均值，按下式計(jì)算菌落直徑和抑菌率：

菌落直徑＝測(cè)量菌落直徑平均值-0.6 cm；

抑菌率＝（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬枝黃蟬乙醇提取物浸膏的提取率

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 kg硬枝黃蟬干粉，采用冷浸提的方法，將濾液減壓濃縮得到770.54 g硬枝黃蟬乙醇提取物浸膏，提取率為7.71%。

2.2 硬枝黃蟬乙醇提取物不同極性段萃取組分抑菌活性的測(cè)定

分別采用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯對(duì)硬枝黃蟬乙醇提取物浸膏進(jìn)行萃取，分別得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分，采用“1.4”節(jié)的方法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。從圖1、表1可以看出，三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病病菌具有較好的抑菌活性，抑菌率分別達(dá)到83.40%、96.92%，石油醚萃取組分的抑菌活性較低。因此，下一步將以乙酸乙酯萃取組分為高活性萃取組分，進(jìn)一步采用硅膠柱層析對(duì)其抑菌活性成分進(jìn)行分離。

表1 硬枝黃蟬乙醇提取物不同萃取組分的抑菌率

2.3 柱層析溶劑洗脫系統(tǒng)的篩選

采用硅膠柱層析對(duì)乙酸乙酯萃取組分進(jìn)行分離時(shí)，首先要篩選合適的溶劑洗脫系統(tǒng)。本試驗(yàn)通過(guò)薄層色板，以Rf值在0.1～0.2范圍內(nèi)的溶劑系統(tǒng)為首選洗脫系統(tǒng)，對(duì)常用有機(jī)溶劑石油醚、正己烷、乙酸乙酯、乙醇等單一溶劑或混合溶劑進(jìn)行展板比較，最終選擇石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)作為硅膠柱層析的洗脫劑。

2.4 抑菌活性成分的分離

在“2.3”節(jié)的基礎(chǔ)上，采用的硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯為溶劑洗脫系統(tǒng)，對(duì)硬枝黃蟬乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中的活性成分進(jìn)行梯度洗脫。設(shè)置石油醚、乙酸乙酯體積比＝20∶1、18∶1、15∶1、12∶1、10∶1、8∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶18、1∶20的洗脫梯度。最后用甲醇清柱，每瓶餾分收集200 mL，一共收集229瓶。

采用TLC展板合并相同的餾分，得到AN-01、AN-02、AN-03、AN-04、AN-05、AN-06、AN-07、AN-08、AN-09、AN-10等10種餾分。

2.5 不同餾分抑菌活性的測(cè)定

采用“1.4”節(jié)的方法對(duì)AN-01、AN-02、AN-03、AN-04、AN-05、AN-06、AN-07、AN-08、AN-09、AN-10等10種餾分的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。

從表2可以看出，餾分AN-02、AN-03和AN-04對(duì)胡椒瘟病病菌具有一定的抑菌活性，抑菌率分別達(dá)到100.00%、100.00%、81.45%。初步確定硬枝黃蟬乙醇提取物對(duì)胡椒瘟病病菌的抑菌活性成分集中在這3個(gè)餾分中，具體是哪一種化合物有待進(jìn)一步分離。

表2 不同餾分的抑菌活性測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，硬枝黃蟬乙醇提取物采用石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯3種溶劑萃取后，三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病病菌的抑菌活性較高，其抑菌率分別達(dá)到了83.40%、96.92%，石油醚萃取組分的抑菌率僅為51.38%。進(jìn)一步對(duì)抑菌活性較高的乙酸乙酯萃取組分進(jìn)行減壓柱層析分離，并采用薄層色板進(jìn)行展板合并，得到AN-01～AN-10等10個(gè)餾分。對(duì)分離的10個(gè)餾分進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果顯示，其中AN-02、AN-03、AN-04對(duì)胡椒瘟病病菌表現(xiàn)出較高的抑菌活性，抑菌率分別達(dá)到了100.00%、100.00%、81.45%。下一步將結(jié)合餾分質(zhì)量和抑菌活性強(qiáng)度對(duì)餾分AN-02、AN-03、AN-04中的抑菌活性進(jìn)行進(jìn)一步分離，從而為開(kāi)發(fā)研制新型植物源殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

目前，已經(jīng)開(kāi)始被應(yīng)用于生產(chǎn)防治植物病害的植物源殺菌劑有大蒜素、苦參堿、根復(fù)特、混合脂肪酸、銀杏提取素、低聚糖素、植物激活蛋白、丁子香酚、黃連素、檸檬醛·烯和丙烯酸·香芹酚等［10］。石志琦等報(bào)道，蛇床子素具有殺蟲(chóng)抑菌的雙重作用；2006年石志琦聯(lián)合江蘇省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司開(kāi)發(fā)了首個(gè)蛇床子素殺菌劑1%蛇床子素水乳劑，用于替代三唑類(lèi)、代森錳鋅等殺菌劑，可以減少化學(xué)農(nóng)藥使用量達(dá)30%～60%，有效保障了農(nóng)產(chǎn)品的安全［11］。張曉艷等研究發(fā)現(xiàn)，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院產(chǎn)地環(huán)境與投入品安全研究室研發(fā)的20%丁香酚水乳劑對(duì)番茄黃化曲葉病毒具有較高的防效［12］。沈陽(yáng)化工研究院在1997年以天然抗生素為先導(dǎo)化合物研制了1種新型甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑烯肟菌酯，其對(duì)瓜類(lèi)、番茄具有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)和提高品質(zhì)的作用，用于防治霜疫霉病、蘋(píng)果葉斑病和小麥赤霉病等［13-14］。李嘉報(bào)道，黃蟬屬植物主要的化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜、木脂素等，其中環(huán)烯醚萜內(nèi)酯成分黃蟬花定、雞蛋花素等具有抗腫瘤和抗真菌的生物活性［15］。Tiwari等研究發(fā)現(xiàn)，從軟質(zhì)黃蟬中分離出的雞蛋花苷顯示出強(qiáng)烈的抗皮膚真菌的活性［16］。因此，在本研究的基礎(chǔ)上，對(duì)硬枝黃蟬中的抑菌活性物質(zhì)有待進(jìn)一步分離。