黃瓜白粉病拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及其生防效果

王海利，張曉慷，王瀅秀，韓金濤，張新剛

（山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院/山東省化學(xué)農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

白粉病別稱白毛病，是一種廣泛發(fā)生的世界性病害。在我國(guó)，夏秋露地和春保護(hù)地黃瓜每年都因白粉病的發(fā)生造成大量減產(chǎn)［1］。黃瓜白粉病是由葫蘆科白粉菌（Erysiphecucur bitacearum）或單絲殼白粉菌（Sphacrotheca fuliginea）引起的［2］，病原菌主要通過氣流傳播，具有潛育期短、再侵染頻繁、流行性強(qiáng)等特點(diǎn)［3］。目前，防治白粉病的主要手段是化學(xué)殺菌劑，但由于白粉病病菌繁殖率很高，同一流行季節(jié)可繁殖多代，加之內(nèi)吸性殺菌劑大多作用位點(diǎn)單一，病菌在藥劑的選擇壓力下極易產(chǎn)生抗藥性，國(guó)內(nèi)外已有黃瓜白粉病病菌對(duì)苯并咪唑類、甾醇生物合成抑制劑類（EBIs）、有機(jī)磷類、羥基嘧啶類、甲氧基丙烯酸酯類、苯氧基喹啉等6類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的研究報(bào)道［4］。隨著環(huán)境法規(guī)制定普及和公眾環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，減輕生態(tài)環(huán)境壓力保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展是未來農(nóng)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)［5］。

近年來，利用微生物防治黃瓜白粉病的研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，Romero等研究3種微生物對(duì)黃瓜白粉病的防效，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對(duì)瓜類白粉病的防治效果接近于2種重寄生菌和醚菊農(nóng)藥對(duì)照［6］。芽孢桿菌作為重要的生防資源已廣泛用于防治植物病害［7-11］。本研究通過對(duì)1株具有黃瓜白粉病生防效果的細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定，確定其遺傳地位。并對(duì)盆栽黃瓜白粉病的防治效果進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，分別與商品化生物農(nóng)藥進(jìn)行對(duì)比，以期為該產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜品種為寶楊5號(hào)，為易感病品種，購(gòu)自上海種子市場(chǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌種分離篩選和活化培養(yǎng)基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，15 g瓊脂，1 000 mL自來水，pH值為7.2～7.4。

種子菌液制備和菌種發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，1 000 mL自來水，pH值為7.2～7.4。

1.1.3 對(duì)照藥劑 100億CFU/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，購(gòu)自美國(guó)拜沃股份有限公司。

1.1.4 試驗(yàn)儀器 主要儀器有搖床、培養(yǎng)箱、潔凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋，均購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗細(xì)菌的分離純化 采用梯度稀釋平板涂布法分離黃瓜白粉病根際土壤中的細(xì)菌［12］，根據(jù)平板上菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2 種子菌液的制備 將分離保存的菌種轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，在28℃溫度條件下培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化，活化后挑取部分菌落接于裝液量為100 mL的250 mL錐形瓶的種子菌液制備培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h即為種子菌液。

1.2.3 發(fā)酵液的制備 將發(fā)酵好的種子液按5%（體積比）的比例接種到裝有200 mL菌種發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h備用。

1.2.4 拮抗細(xì)菌的篩選 以黃瓜白粉病病原菌為指示菌，采用活體生測(cè)法，篩選對(duì)其有效的拮抗細(xì)菌。在溫室條件下，挑選飽滿的黃瓜種子播種到小花盆里，保濕，置于25℃室溫下光照培養(yǎng)。待黃瓜幼苗長(zhǎng)出2張真葉時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的黃瓜苗，將分離篩選的細(xì)菌發(fā)酵液濃度調(diào)至1010CFU/mL，噴灑于黃瓜葉片上，待藥液晾干后接種孢子濃度大概為10萬個(gè)/mL左右的懸浮液，用接種噴霧器在黃瓜苗上均勻噴霧接種，大概接種2 h（為確定篩選的拮抗細(xì)菌是否具有預(yù)防效果，于接種白粉病菌前24 h進(jìn)行發(fā)酵液的噴灑）后試材自然風(fēng)干，然后移至恒溫（24℃左右）室燈光下，培養(yǎng)期間每天保溫、保濕。于1、2周后按黃瓜白粉病的常規(guī)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及方法計(jì)算病情指數(shù)和防治效果，每個(gè)處理重復(fù)3次。對(duì)照藥劑為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，以清水作為空白對(duì)照。

醬油主要由大豆、淀粉、和小麥粉經(jīng)過發(fā)酵而成，這些成分在被人體吃下之后都會(huì)變成無色的氨基酸和多肽混合物，而其黑色來源于其中所含的焦糖色素，并不會(huì)促進(jìn)黑色素形成也不會(huì)沉積在皮膚或傷口上，不必?fù)?dān)心變黑。

1.2.5 生防菌株SDNY-038對(duì)黃瓜白粉病溫室盆栽生物活性的檢測(cè) 采取盆栽的方法，檢測(cè)生防菌株SDNY-038試驗(yàn)樣品對(duì)黃瓜白粉病的活體抑制效果。檢測(cè)方法同拮抗細(xì)菌的篩選。

1.2.6 生防菌株SDNY-038的鑒定

1.2.6.1 生防菌株SDNY-038的培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征 在活化培養(yǎng)基上觀察菌株SDNY-038的生長(zhǎng)情況，菌落形態(tài)采用革蘭氏染色，按常規(guī)操作試驗(yàn)［13］。

1.2.6.2 生防菌株SDNY-038的16S rDNA片段的擴(kuò)增與序列分析 菌株基因組DNA的提取參照Sambrook等的方法［14］；引物為擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物［15］，正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-ACGGCTA CCTTGTTACGACT-3′。PCR產(chǎn)物由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測(cè)序中心進(jìn)行測(cè)序，將結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast同源序列檢索。采用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行多序列匹配排列，用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包MEGA 3.1轉(zhuǎn)化成Mega格式后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用Kimura-2-Parameter模型，用鄰接法（neighborjoining，簡(jiǎn)稱NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉分析10 000次重復(fù)檢測(cè)分子系統(tǒng)樹的置信度，最后確定菌株SDNY-038的分類地位。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離篩選

采用活體生測(cè)方法對(duì)土壤中分離得到的細(xì)菌進(jìn)行篩選，對(duì)黃瓜白粉病致病菌有防效的菌株相對(duì)較少，拮抗能力較強(qiáng)的菌株只占2.5%左右，有較弱拮抗作用的菌株占5%，其他均無防效。選取拮抗能力較強(qiáng)的1株拮抗細(xì)菌編號(hào)為SDNY-038，經(jīng)過多次復(fù)篩，均表現(xiàn)出較好的生防效果，提前2 h噴灑和提前24 h噴灑與清水對(duì)照相比均具有顯著性差異，提前2 h噴灑在7、14 d后的防治效果分別為87.45%、87.35%，提前24 h噴灑在7、14 d后的防治效果分別為57.84%、41.70%，提前2 h噴灑比提前24 h噴灑在7、14 d后分別提高29.61、45.65百分點(diǎn)（圖1）。

2.2 生防菌株SDNY-038對(duì)黃瓜白粉病盆栽防治效果

盆栽測(cè)定結(jié)果顯示，對(duì)生防菌株SDNY-038在施藥7 d后的噴施效果進(jìn)行調(diào)查，生防菌株SDNY-038的病情指數(shù)和防治效果分別為3.31、78.00%，防治效果比陽性對(duì)照藥劑高出59.93百分點(diǎn)，14 d后的病情指數(shù)和防治效果分別為12.11、84.67%，防治效果比陽性對(duì)照藥劑高出66.37百分點(diǎn)，病情指數(shù)與防治效果與空白對(duì)照相比均呈顯著性差異（圖2）。

2.3 生防菌株SDNY-038的形態(tài)特征以及生理生化鑒定結(jié)果

生防菌株SDNY-038在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落呈圓形，乳白色，不透明，無皺褶，邊緣不規(guī)則，菌落表面光滑，濕潤(rùn)，經(jīng)革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽性菌，能水解淀粉和還原硝酸鹽，葡萄糖、木糖、甘露糖以及檸檬酸鹽生長(zhǎng)試驗(yàn)反應(yīng)均為陽性。

2.4 生防菌株SDNY-038的16S rDNA的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

經(jīng)測(cè)序，生防菌株SDNY-038的16S rDNA全長(zhǎng)序列為1 471 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)合進(jìn)化樹（圖3）分析，結(jié)果顯示其與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）相關(guān)家族親緣關(guān)系最為接近，同源性達(dá)到99%。結(jié)合相關(guān)的形態(tài)特征以及生理生化鑒定結(jié)果，可以初步判斷生防菌株SDNY-038為芽孢桿菌。

3 討論與結(jié)論

近幾年，隨著國(guó)家對(duì)環(huán)境安全越來越重視，化學(xué)農(nóng)藥新品種的登記以及產(chǎn)品生產(chǎn)的門檻越來越高，生物農(nóng)藥的研制成為大勢(shì)所趨，發(fā)掘高效低毒的生物農(nóng)藥并不容易，盡管過去幾年人們開發(fā)的生物農(nóng)藥數(shù)不勝數(shù)，但真正有較好防治效果的產(chǎn)品是少之又少。對(duì)黃瓜白粉病具有防效的生防菌在國(guó)內(nèi)外有不少的報(bào)道［16-18］，說明生防菌用于黃瓜白粉病的防治具有較大的發(fā)掘潛力。

通過對(duì)黃瓜白粉病根際土壤菌進(jìn)行分離純化，以及活體黃瓜白粉生測(cè)試驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)1株對(duì)白粉病具有較好防治效果的生防細(xì)菌，通過對(duì)該菌株16S rDNA進(jìn)行鑒定，結(jié)合相關(guān)的生理生化特征，發(fā)現(xiàn)其與芽孢桿菌屬于同一屬，具有較好的預(yù)防保護(hù)效果，在對(duì)幼苗處理7、14 d后的防效分別達(dá)到78.00%、84.67%，持效期較長(zhǎng)，具有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。