紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)Vtg基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析的引物設(shè)計(jì)與評(píng)估

藏 林，封 巖，門 磊，仇雪梅，王秀利

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600)

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)隸屬于鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、東方鲀屬(Takifugu)。它是幾種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一，由于其肉質(zhì)細(xì)膩、肉味鮮美，魚肉中有含量極高的蛋白質(zhì)，魚皮含有豐富的膠原蛋白，已在中國(guó)、韓國(guó)及日本等亞洲國(guó)家廣泛培育[1]。

野生河豚常含有致命的毒性河豚毒素(TTX)，尤其是在雌魚的卵巢中[2]。河豚毒素是一種極為有效的神經(jīng)毒素，它特異性地與肌肉和神經(jīng)組織中的電壓門控鈉通道結(jié)合，并阻斷鈉離子通道進(jìn)入神經(jīng)元[3-5]。野生河豚通常通過(guò)食物鏈對(duì)毒素進(jìn)行生物累積，在特定組織(如肝臟、卵巢和皮膚)中產(chǎn)生大量的河豚毒素[6]。當(dāng)喂食含河豚毒素的食物時(shí)，無(wú)毒人工培養(yǎng)的河豚魚的肝臟、卵巢和皮膚中都高水平積累了河豚毒素[7-8]。這種河豚毒素最有可能通過(guò)飲食口服，然后從腸道吸收，通過(guò)血液循環(huán)分配，并運(yùn)輸?shù)礁闻K[9-10]。在雌性河豚魚的肝臟中有一部分河豚毒素在成熟期被轉(zhuǎn)運(yùn)到了卵巢中。有研究表明人工經(jīng)靜脈注入河豚毒素時(shí)，河豚毒素在肝臟中的含量明顯隨著河豚毒素注射量的增加而增加，這表明河豚毒素存儲(chǔ)在肝臟中是毒化紅鰭東方鲀的第一個(gè)步驟[11]。

卵黃蛋白原( Vitellogenin，Vtg)是卵黃蛋白(Yolk protein)的前體，存在于幾乎所有卵生物種的雌性中，包括魚類、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類，以及大多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物。Vtg主要是在肝臟中的雌激素17β-雌二醇的刺激下產(chǎn)生，通過(guò)體循環(huán)分布全身，并隨血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入到卵巢。在進(jìn)入卵巢的過(guò)程中，特異性受體錨定在卵母細(xì)胞質(zhì)膜并與卵黃蛋白原結(jié)合，并成為與他們的卵黃蛋白原內(nèi)化的配體。 Ikeda在日本長(zhǎng)崎縣使用處于成熟期的野生河豚魚，在測(cè)得促性腺激素指數(shù)(GSI)增加的情況下，卵巢中的毒性也隨之增加，而同時(shí)肝臟毒性顯著下降[12]。卵黃蛋白原儲(chǔ)存在早期卵母細(xì)胞體內(nèi)，然后裂解成脂質(zhì)細(xì)胞(I和II)，卵黃蛋白和vWF D型結(jié)構(gòu)域[13-14]。卵黃蛋白原除了有卵黃蛋白的前體的作用外，卵黃生成素還可作為金屬、無(wú)機(jī)磷酸鹽、脂質(zhì)和碳水化合物的載體蛋白[15-16]。

實(shí)時(shí)定量PCR(real-time fluorescence-quantitative PCR，qPCR)是一種具有高靈敏度、可重復(fù)性的基因表達(dá)譜分析技術(shù)。作為最靈敏、精確、可重復(fù)的定量特異RNA的技術(shù)之一，它現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，并成為驗(yàn)證微陣列和RNA-seq數(shù)據(jù)的最常用方法[17-19]。

本文應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，擬獲得紅鰭東方鲀Vtg基因基于qPCR表達(dá)分析的相關(guān)引物，為今后分析紅鰭東方鲀的 Vtg基因的表達(dá)譜、深入探討河豚毒素在肝臟和卵巢中富集與分布奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用18月齡的紅鰭東方鲀50尾，采自大連天正實(shí)業(yè)有限公司。麻醉后，采集新鮮的紅鰭東方鲀肝臟和尾鰭組織，立即儲(chǔ)存在液氮中，然后在-80 ℃的超低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 性別鑒定 將上述50尾紅鰭東方鲀解剖，根據(jù)性腺發(fā)育的程度、形狀和顏色進(jìn)行性別鑒定，具體鑒別方法按照參考文獻(xiàn)20、21的方法進(jìn)行。

1.2.2 總RNA的提取 隨機(jī)取15尾雌性紅鰭東方鲀等量大小的肝臟組織樣品，置于有液氮的研缽中進(jìn)行研磨，直至呈粉末狀，混合后用于總RNA的提取。按照RNAiso plus(Takara Biotechnology (Dalian) Co.,Ltd.)的說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取，具體步驟如下：取研磨后的粉末狀混合物50～100 mg于離心管中，加入1 mL的 RNAiso plus，室溫靜置10 min，12 000 r/ min，4 ℃離心15 min，取上清移至1.5 mL離心管中；加入200 μL氯仿，劇烈震蕩混勻至呈乳白色，室溫靜置10 min，12 000 r/ min，4 ℃離心15 min，取約400 μL上清轉(zhuǎn)移至新離心管中；加入等體積約400 μL異丙醇，緩慢顛倒混勻10次，于-20 ℃條件中靜置20 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，棄去上清留沉淀部分；加入1 mL的75%現(xiàn)配乙醇，于12 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄乙醇保留沉淀，重復(fù)兩次；得到的沉淀物在無(wú)酶環(huán)境下進(jìn)行沉淀干燥2～5 min后，溶于 DEPC水中，暫存于4 ℃冰箱中使其充分溶解后，保存于-80 ℃超低溫冰箱留用。用超微量分光光度計(jì)Aligent2000對(duì)溶解完全后的RNA進(jìn)行波長(zhǎng)長(zhǎng)度為260 mm和280 mm的濃度及純度分析；隨后對(duì)其進(jìn)行1%的普通瓊脂糖凝膠、恒壓電泳分離系統(tǒng)進(jìn)行電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)初步測(cè)定提取的總RNA完整性進(jìn)行觀察與拍照。

1.2.3 cDNA第一條鏈的合成 選取 OD260/OD280在1.8～2.0之間的 RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara Biotechnology (Dalian) Co.,Ltd.)的說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。具體反應(yīng)體系如下： 2 μL 5×PrimeScript Buffer、0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I、0.5 μL Oligo dT primer、0.5 μL Random6 mers、3 μL模板和3.5 μL RNase free H2O。 反應(yīng)條件： 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)及常規(guī)PCR的篩選 下載紅鰭東方鲀卵黃蛋白原Vtg-1的基因序列(GenBank號(hào)：XM_011614929.1)，利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

取雌性紅鰭東方鲀肝臟的cDNA 進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增Vtg-1基因片段。擴(kuò)增總體積為25 μ L，其中上下游引物各0.5 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶0.4 μL， ddH2O 18.1 μL，cDNA模板1 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃，5 min預(yù)變性；94 ℃，30 s變性； 8 ℃，30 s退火； 72 ℃，30 s延伸，35個(gè)總循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的普通瓊脂糖凝膠和恒壓電泳分離系統(tǒng)上進(jìn)行電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)初步測(cè)定提取的總RNA完整性進(jìn)行觀察與拍照。對(duì)得到的Vtg-1基因的單個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)NCBI BLAST程序在線比較和驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。

1.2.5 qPCR引物的設(shè)計(jì)與評(píng)估 根據(jù)測(cè)序后獲得的Vtg-1基因序列獲得的qPCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)原理，使用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，并在常規(guī)PCR檢測(cè)后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA原液為模板，采用5點(diǎn)10倍稀釋法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)在ABI Step One Plus實(shí)時(shí)定量PCR儀上利用全式金TransStart?TopGreen qPCR SuperMix 的試劑盒進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為 20 μL：其中包括 MIX Buffer 10 μL，Dye 0.4 μL，RNAse Free ddH2O 7.4 μL，正反向引物濃度為10 μm/ L各0.6 μL和模板1 μL，每個(gè)樣品3次重復(fù)，反應(yīng)條件為：94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；58 ℃，15 s；72 ℃，25 s；40個(gè)循環(huán)。 觀察熔解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定Ct值。擴(kuò)增體系條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備條件相同，取上述 cDNA 為模板，進(jìn)行qPCR定量實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測(cè)

紅鰭東方鲀肝組織的總RNA顯示28 s rRNA和18 s rRNA的條帶亮度比在1和2之間(圖1)， OD260/OD280均在1.8～2.0之間。

2.2 常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)、篩選及驗(yàn)證

根據(jù)紅鰭東方鲀卵黃蛋白原 Vtg-1的基因序列( XM_011614929.1)，利用軟件 Primer5.0設(shè)計(jì)引物，篩選出了兩對(duì)適宜進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物(表1)。

圖1 紅鰭東方鲀肝臟組織的總RNA電泳圖

引物名稱引物序列(5’-3’)擴(kuò)增產(chǎn)物大小(理論值)/bpTm/℃擴(kuò)增產(chǎn)物名稱Vtg-1F1TTGGCAGCTCTGGAGTTCCT31859.7VtgF1-VtgR1Vtg-1R1GGGCATCGGGTATTTCGTTC61.7Vtg-1F2 ATGGACAAACCCACGAACAG23457.9VtgF2-VtgR2Vtg-1R2AAGGGCATCGGGTATTTCGT61.0

圖2 常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果注：泳道M：DNA分子標(biāo)量；泳道1～2：由引物對(duì)VtgF1-VtgR1擴(kuò)增的Vtg基因的PCR產(chǎn)物；泳道3～4：由引物對(duì)VtgF2-VtgR2擴(kuò)增的Vtg基因的PCR產(chǎn)物

將紅鰭東方鲀肝臟組織的cDNA用作模板，對(duì)表1中所示的兩對(duì)引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增篩選。如圖2所示，引物VtgF1-VtgR1的擴(kuò)增產(chǎn)物僅具有約320 bp的一條擴(kuò)增條帶(泳道1、2)；引物 VtgF2- VtgR2的擴(kuò)增產(chǎn)物在240 bp處有清晰的一個(gè)擴(kuò)增條，但在小于100 pb處有較為明顯引物帶，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，判斷為引物二聚體，不適合表達(dá)分析(泳道3、4)。

對(duì)上述擴(kuò)增后所得到的產(chǎn)物Vtg-1進(jìn)行測(cè)序，得到長(zhǎng)度為316 bp的序列。將獲得的序列進(jìn)行GenBank BLAST在線比對(duì)，結(jié)果顯示：與已報(bào)報(bào)道的紅鰭東方鲀Vtg-1基因(序列號(hào)： XM_011614929.1)相比，本研究測(cè)序所得的由引物對(duì)VtgF1-VtgR1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物序列的與Vtg-1基因的源性可達(dá)99%(圖3)。

圖3 由引物對(duì)VtgF1-VtgR1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物序列與Vtg-1基因序列的BLAST對(duì)比結(jié)果

2.3 qPCR引物的設(shè)計(jì)與評(píng)估

2.3.1 qPCR引物的設(shè)計(jì) 在常規(guī)PCR擴(kuò)增引物的篩選中，由引物對(duì)VtgF1-VtgR1的擴(kuò)增產(chǎn)物僅具有一個(gè)擴(kuò)增條帶，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增。但在測(cè)序后，擴(kuò)增條帶大小為316 bp。該對(duì)引物不太適用于 qPCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。 根據(jù)得到的由引物對(duì)VtgF1-VtgR1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物序列再設(shè)計(jì)一對(duì)較適于qPCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物：VtgF-VtgR，擴(kuò)增片段大小約133 bp(表2)。

表2 擬用于qPCR擴(kuò)增的引物序列信息

2.3.2 引物的qPCR評(píng)估 根據(jù)qPCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物對(duì)VtgF-VtgR的Tm值，進(jìn)行退火溫度為55 ℃、58 ℃和60 ℃這3個(gè)溫度下的qPCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示qPCR擴(kuò)增的Ct值在58 ℃的退火溫度下最小(表3)。 因此在退火溫度為58 ℃時(shí)，進(jìn)行引物VtgF-VtgR的qPCR擴(kuò)增最為適宜。

采用引物對(duì)VtgF-VtgR在58 ℃作為退火溫度，應(yīng)用10倍稀釋法進(jìn)行cDNA模板樣品的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)結(jié)果顯示：在指數(shù)擴(kuò)增區(qū)域中彼此相鄰的擴(kuò)增曲線均勻隔開(圖4-A)，并且每個(gè)反應(yīng)的熔解曲線在Tm處為82.72是單個(gè)尖峰(圖4-B)，并且該引物標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為105.32%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2值為0.999(圖4-C)。

表3 引物VtgF-VtgR在不同退火溫度下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增時(shí)得到的Ct值

圖4 引物對(duì)VtgF-VtgR qPCR的擴(kuò)增曲線

3 討論

當(dāng)使用實(shí)時(shí)定量qPCR通過(guò)基因表達(dá)譜分析技術(shù)對(duì)靶基因表達(dá)時(shí)，提取的總RNA的完整性和純度是影響擴(kuò)增效率的最基本因素。如果提取的總RNA質(zhì)量差或被污染，則產(chǎn)生的數(shù)據(jù)會(huì)有偏差，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。當(dāng)提取的RNA樣本通過(guò)瓊脂糖電泳分析時(shí)，電泳圖上有明顯的兩條帶28 s和18 s帶，并且28 s/18 s rRNA的帶亮度比在1和2之間，表明其具有良好的完整性。通過(guò)測(cè)定，本研究得到的總RNA的OD260/OD280比值在1.8和2.0之間，表示RNA樣品純度高，不含蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，滿足實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)總RNA的要求。

所設(shè)計(jì)引物的序列對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性以及擴(kuò)增效率至關(guān)重要。普通 PCR擴(kuò)增的引物一般長(zhǎng)度在15～30個(gè)堿基之間最好，GC含量為50%～60%。此外，上游和下游引物的GC含量不應(yīng)太大，Tm為55～65 ℃之間，引物自身和引物間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，從而避免產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體。對(duì)于qPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度優(yōu)選為80～250 bp，最合適的長(zhǎng)度約在150 bp左右。 本研究基于已公布的紅鰭東方鲀卵黃蛋白原Vtg-1的基因序列信息(GenBank號(hào)： XM_011614929.1)，設(shè)計(jì)出兩對(duì)引物，即：VtgF1-VtgR1和VtgF2-VtgR2，所得到擴(kuò)增出的序列大小分別為320 bp和240 bp。在常規(guī)PCR中，引物對(duì)VtgF1-VtgR1的擴(kuò)增片段大小約為320 bp，這與理論值一致，并且擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有雜質(zhì)帶。與第一對(duì)引物相比，引物對(duì)VtgF2-VtgR2的擴(kuò)增產(chǎn)物除了主帶之外還具有一條引物帶。第一對(duì)引物具有很強(qiáng)的擴(kuò)增特異性，但其擴(kuò)增片段的大小不符合qPCR擴(kuò)增的最佳要求。因此，本研究對(duì)引物對(duì)VtgF1-VtgR1擴(kuò)增出的產(chǎn)物序列進(jìn)行重新設(shè)計(jì)得到適用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物：VtgF-VtgR，擴(kuò)增片段大小約為133 bp，與理論值大小相一致，因此可以通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)引物對(duì)VtgF-VtgR進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。

在進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR的過(guò)程中，設(shè)置了陰性對(duì)照，且陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增信號(hào)；對(duì)于每個(gè)擴(kuò)增樣品濃度設(shè)定三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并且這些重復(fù)樣品的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于0.5，否則結(jié)果將是不可靠的并且需要重新擴(kuò)增。在該實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照顯示沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)，并且擴(kuò)增樣品值的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.5，這證明了測(cè)試數(shù)據(jù)的可靠性。

退火溫度的高低直接影響 PCR結(jié)果的好壞，不適宜的退火溫度會(huì)導(dǎo)致引物非特異性的擴(kuò)增或者會(huì)形成引物二聚體，因此在實(shí)驗(yàn)中，要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化[22]。引物擴(kuò)增的特異性在進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中起關(guān)鍵性作用，在進(jìn)行退火溫度優(yōu)化的同時(shí)要進(jìn)行熔解曲線的分析，以此判斷引物擴(kuò)增的特異性[23]。如果獲得的熔解曲線是單峰，則表明引物擴(kuò)增具有特異性；相反，如果在熔解曲線上不僅存在一個(gè)波峰，則表明該引物有非特異性的擴(kuò)增。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)引物的 Tm值的結(jié)果顯示，當(dāng)退火溫度為58 ℃時(shí)，該引物擴(kuò)增的 Ct值最小，有且只有一個(gè)波峰。因此，58 ℃的退火溫度是本實(shí)驗(yàn)較適合于qPCR分析的。

除擴(kuò)增特異性外，引物應(yīng)具有良好的擴(kuò)增效率，以便最終用于實(shí)驗(yàn)樣本的實(shí)時(shí)定量PCR的分析。擴(kuò)增效率一般可通過(guò)對(duì)按照十倍比稀釋的c DNA模板進(jìn)行定量分析建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定。優(yōu)化后的結(jié)果有以下特點(diǎn)：1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2>0.980；2、高擴(kuò)增效率，即擴(kuò)增效率在90%～105%；3、具有一致的重復(fù)反應(yīng)。遞減的直線關(guān)系等式和標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2常常被用來(lái)判斷反應(yīng)條件是否優(yōu)化。擴(kuò)增效率接近100%是優(yōu)化的重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)的最好標(biāo)志，在實(shí)際操作時(shí)，反應(yīng)擴(kuò)增效率應(yīng)在90%～105%之間[24]，如果擴(kuò)增效率低，可能的原因是引物設(shè)計(jì)的不當(dāng)，或者是反應(yīng)條件未優(yōu)化；擴(kuò)增效率過(guò)高，可能的原因是系列稀釋樣品加樣錯(cuò)誤，或者有非特異性擴(kuò)增，如引物二聚體[25]。此次實(shí)驗(yàn)引物 VtgF-VtgR的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析顯示：引物的擴(kuò)增效率為105.32%，R2值為 0.999；定量結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，熔解曲線是單峰值。上述結(jié)果說(shuō)明，該對(duì)引物具有良好的擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率，滿足了實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的要求。

通過(guò)引物對(duì) VtgF-VtgR的退火溫度優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，結(jié)果表明，該對(duì)引物適用于紅鰭東方鲀 Vtg基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析。本研究結(jié)果為紅鰭東方鲀Vtg基因的組織表達(dá)譜分析及不同發(fā)育階段的定量表達(dá)分析奠定了基礎(chǔ)。