尼克酸治療惡性黑素瘤的相關(guān)機(jī)制研究

陳 龍 ，高 濤 ，唐海燕 ，李彥希 △

（1.梁平區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶，405200；2.重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶，400011）

皮膚黑素瘤是來(lái)源于神經(jīng)嵴表皮黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)化而成的腫瘤，是目前全球死亡率最高的皮膚腫瘤，在2015年黑素瘤全球患病人數(shù)高達(dá)351 880人，為5/10萬(wàn)[1]，每年發(fā)病率都在持續(xù)增長(zhǎng)，且特別容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，高轉(zhuǎn)移性是黑素瘤最重要的特征，也是區(qū)別于其他非黑素瘤上皮來(lái)源的皮膚癌特征之一[2]。過(guò)去20年，我們對(duì)黑素瘤侵襲的一般機(jī)制和黑素瘤特異性機(jī)制的理解都有了顯著的提高，但迄今為止還沒(méi)有有效的治療策略來(lái)應(yīng)對(duì)黑素瘤細(xì)胞的侵襲特性。黑素細(xì)胞來(lái)源于神經(jīng)嵴，在發(fā)育過(guò)程中多種信號(hào)因子的作用下，遷移到毛囊、皮膚、粘膜等處，遷移過(guò)程中最重要的環(huán)節(jié)就是EMT(epithelial-mesenchymal transition上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)，EMT過(guò)程通過(guò)破壞粘附連接和緊密連接來(lái)加速上皮細(xì)胞和細(xì)胞粘附的降解,最早在1980年由Elizabeth Hay提出[3]，他在原始的雞胚中觀察到上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞過(guò)度的現(xiàn)象。在此過(guò)程中，細(xì)胞的粘附、極性、遷移等屬性都會(huì)發(fā)生改變，上皮細(xì)胞會(huì)失去它們的粘附性和極性，重組他們的細(xì)胞骨架，在一些重組細(xì)胞形態(tài)和重組基因的表達(dá)的信號(hào)分子也會(huì)隨之改變。EMT過(guò)程中間質(zhì)標(biāo)記如Snail1表達(dá)增加，上皮性標(biāo)記如E-cadherin則下調(diào)，這一過(guò)程已被證明在正常發(fā)育過(guò)程如中胚層和神經(jīng)嵴遷移是至關(guān)重要的[4-5]。在傷口愈合、纖維化及腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中也有著上述過(guò)程[6-8]。EMT賦予腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、干細(xì)胞樣的屬性，很大程度上是腫瘤免疫抑制和復(fù)發(fā)的重要原因[9-10]。因此，抑制EMT在癌癥治療的諸多方面都非常關(guān)鍵。

尼克酸（Nicotinic acid，NA）又名維生素B3，煙酸，或維生素PP，是一種水溶性維生素，維生素B家族成員之一，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討尼克酸對(duì)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞遷移是否有抑制作用，以及不同濃度尼克酸對(duì)黑素瘤細(xì)胞的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公 司，DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公 司，尼克酸、臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公 司，光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRⅡ購(gòu)自日本Takara公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自Bio-Rad公司。引物由上海嘉根生物科技有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)B16-F10細(xì)胞以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。傳代后置于5%二 氧化碳培養(yǎng)箱37℃正常培養(yǎng)備用。

1.2.2 Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn) 選用 8.0μm孔徑的Transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。預(yù)先將B16-F10細(xì)胞饑餓處理2h，胰酶消化，配制成無(wú)血清細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為105個(gè)/mL)。取100μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室。然后取含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基500μL加入下室。再向上室加入不同量尼克酸PBS溶液，形成1μM,5μM,10μM三個(gè)濃度梯度，對(duì)照組加入相當(dāng)量PBS。5%二氧化碳培養(yǎng)箱37℃正常培養(yǎng)24h。棉簽擦去上室膜內(nèi)細(xì)胞，甲醛固定10min；0.1%結(jié)晶紫 室溫 染色3min，蒸溜水漂洗3*5min。Transwell小室置于顯微鏡下觀察膜下表面細(xì)胞，以膜下細(xì)胞的數(shù)量表示黑色素瘤細(xì)胞遷移能力，隨機(jī)選取視5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)，求平均值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.3 細(xì)胞遷移相關(guān)基因表達(dá)變化 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，提取取對(duì)照組及10μM尼克酸干預(yù)24h組細(xì)胞總RNA，以RNA為模版，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。再以cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)相關(guān)目的基因表達(dá)水平。每次兩個(gè)副孔取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次。Snail1、snail2、twist、e-cardherin及β-actin基因引物序列見(jiàn)表一。

1.2.4 細(xì)胞活率檢測(cè) 取對(duì)照組及10μM尼克酸干預(yù)24h組細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml），與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9:1混合混勻，在三分鐘內(nèi)，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。細(xì)胞活率計(jì)算方法為：活細(xì)胞率（%）= 活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)SEM表示。組間均數(shù)采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 尼克酸干預(yù)對(duì)細(xì)胞遷移的影響

通過(guò)Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，尼克酸對(duì)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞的遷移有明顯的抑制作用，且呈濃度依耐關(guān)系（圖1）。在尼克酸干預(yù)濃度為10μM時(shí)，抑制細(xì)胞遷移效果最明顯（*P＜0.05, **P＜0.01）。

圖1

2.2 尼克酸干預(yù)對(duì)細(xì)胞遷移相關(guān)基因表達(dá)影響

10μM尼克酸干預(yù)組與對(duì)照組相比，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的相關(guān)基因snail2和twist表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，而抑制腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)基因E-cardherin明顯增加（P＜0.05）。

圖2

2.3 尼克酸干預(yù)對(duì)細(xì)胞活率影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10μM尼克酸干預(yù)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞活率統(tǒng)計(jì)無(wú)明顯差異。提示10μM尼克酸可顯著抑制B16-F10細(xì)胞遷移，但并不影響細(xì)胞的存活。

圖3

表1 相關(guān)基因引物序列表

3 討 論

黑素母細(xì)胞高度活躍，在整個(gè)胚胎中遷移，定值于表皮基底層，最終在那里分化成成熟的黑素細(xì)胞，與表皮角化細(xì)胞均保持恒定關(guān)系。這種恒定關(guān)系主要通過(guò)鈣粘蛋白（E-cardherin、N-cardherin等）、連接蛋白和其他粘附受體使黑素細(xì)胞和周?chē)琴|(zhì)細(xì)胞緊密聯(lián)系[11]，每一個(gè)黑素細(xì)胞通過(guò)樹(shù)突與30-40個(gè)相鄰的角質(zhì)形成細(xì)胞接觸，形成粘附結(jié)構(gòu)，其形態(tài)、生長(zhǎng)、粘附和遷移都受控于鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞。在黑素瘤的早期，重新活化的黑素瘤細(xì)胞在表皮中開(kāi)始不受控制的增殖，表現(xiàn)為皮膚原位癌[12]，但這些黑素瘤細(xì)胞很容易受到微環(huán)境和一些分子信號(hào)的影響，刺激其侵襲性和誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)，此時(shí)，周?chē)琴|(zhì)細(xì)胞失去對(duì)黑素瘤細(xì)胞的粘附作用，不僅如此，表皮細(xì)胞還產(chǎn)生肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，下調(diào)E-cadherin，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，加速基底膜的破壞，并激活Notch信號(hào)，通過(guò)上調(diào)miR-222/221誘導(dǎo)侵襲 。瘤細(xì)胞進(jìn)入真皮后主要通過(guò)淋巴（16%-47%）和血管轉(zhuǎn)移（高于70%）。因此治療黑素瘤的關(guān)鍵在于抑制瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

尼克酸是輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其磷酸形式NADP的組成部分，能調(diào)控細(xì)胞的能量代謝，影響氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和死亡的多種途徑[12]。NA參與細(xì)胞粘附、極性、遷移、增殖和分化的調(diào)控等多種活動(dòng)，最重要的是對(duì)分化細(xì)胞具有去分化功能。在煙酸缺乏癥的患者中非常重要的特征是對(duì)紫外線敏感，這是因?yàn)槿狈熕釋?dǎo)致的對(duì)紫外線的損傷修復(fù)不足造成的，體內(nèi)研究表明口服煙酸可降低紫外線誘導(dǎo)的免疫抑制，加速紫外線照射的人HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞和體外皮膚的DNA修復(fù)，降低皮膚癌的發(fā)病率。雙盲隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)煙酸能明顯降低日光性角化的發(fā)病率 。Ma et al.認(rèn)為高濃度的NA (50mM)能調(diào)節(jié)辣椒素受體TRPV1-4的活性，超過(guò)50mM的NA 能使3T3細(xì)胞的細(xì)胞骨架分解，并能抑制爪蛙細(xì)胞內(nèi)黑素的轉(zhuǎn)運(yùn) 。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尼克酸能明顯抑制B16-F10黑色素瘤細(xì)胞的遷移，且呈濃度依耐關(guān)系，在尼克酸干預(yù)濃度為10μM時(shí)，抑制細(xì)胞遷移效果最明顯。細(xì)胞遷移能力降低預(yù)示著轉(zhuǎn)移能力下降，因此降低了腫瘤的侵襲性，黑素瘤治療的關(guān)鍵在于抑制瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，因此為NA體外治療MM提供了有力的理論依據(jù)。三期臨床實(shí)驗(yàn)中每日給予1g煙酰胺的口服劑量，對(duì)386個(gè)KC患者觀察發(fā)現(xiàn)煙酰胺對(duì)KC有化學(xué)防護(hù)作用 ，但在體外黑素瘤患者需要口服的煙酸劑量目前還無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，需進(jìn)一步深入研究。

鋅指蛋白家族中的Twist、Snail是調(diào)節(jié)EMT重要的轉(zhuǎn)錄因子。在黑素瘤的發(fā)病的分子機(jī)制中，snail介導(dǎo)的E-cadherin的下調(diào)，E-cadherin的下調(diào)被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵特征，與皮膚惡性黑色素瘤預(yù)后不良正相關(guān)，使得與角質(zhì)細(xì)胞的粘附力下降 ，此外snail還可以通過(guò)誘導(dǎo)免疫抑制加速黑素瘤的轉(zhuǎn)移 。在MM 過(guò)程中，干擾這些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)或功能，使得細(xì)胞信號(hào)改變，進(jìn)而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞失去上皮特性。細(xì)胞連接主要為粘附連接，緊密連接和橋粒連接，細(xì)胞粘附蛋白對(duì)于維系上皮細(xì)胞特性尤為重要，細(xì)胞間粘附力下降還會(huì)引起細(xì)胞骨架的改變，這又反之加速細(xì)胞粘附力的下降。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NA能使EMT上游轉(zhuǎn)錄因子snail泛素化和退化，進(jìn)而使得下游的E-cadherin增高，增加細(xì)胞間的粘附。 E-cardherin上調(diào)，E-cardherin主要位于上皮組織，從而增大細(xì)胞間的粘附，有效阻止了黑素瘤細(xì)胞的活性，因此尼克酸干預(yù)下，B16-F10黑色素瘤細(xì)胞的遷移明顯受阻。因此，在體外煙酸還能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，綜上所述，NA能在體外抑制黑素瘤細(xì)胞的遷移，這為NA治療黑素瘤提供了又一理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究從分子機(jī)制深入討論了體外尼克酸通過(guò)對(duì)上游轉(zhuǎn)錄因子的影響，使得下游粘附蛋白發(fā)生變化，進(jìn)而改變細(xì)胞粘附，抑制黑素瘤細(xì)胞的遷移，為治療黑素瘤提供了新的臨床思路和理論基礎(chǔ)。