糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇提取方法的驗(yàn)證與優(yōu)化

郝全英 ，王麗娟，郭建君，劉芳芳 ，楊 柯

（1.山西糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，山西 晉中 030600；2.北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司，北京 100037）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （deoxynivalenol,DON）是一種主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素，存在于小麥、大麥、燕麥、黑麥和玉米等谷類作物中，在全球污染普遍，對(duì)谷物的污染率和污染水平居鐮刀菌毒素之首，是各國重點(diǎn)控制的真菌毒素之一。禾谷鐮刀菌在適宜的氣溫和濕度等條件下繁殖并產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)動(dòng)物和人均有一定的毒性。2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單初步整理后，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在3類致癌清單中。

本文以小麥、玉米中DON對(duì)其提取方法為例進(jìn)行驗(yàn)證與優(yōu)化，主要參考標(biāo)準(zhǔn)包括：GB/T 2761-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》、GB 5009.111-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法、GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》。按照GB 5009.111-2016中給定的方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合免疫親和柱的操作手冊(cè)對(duì)GB 5009.111-2016中提取DON的方法進(jìn)行驗(yàn)證，使回收率得到提高。本方法凈化效果好、準(zhǔn)確度高、平行度好，可以滿足糧食中DON的限量檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

保水式盤式粉碎磨，LM3303，瑞典波通儀器公司；安捷倫1260 Infinity高效液相色譜儀，包括安捷倫紫外檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，四元梯度泵;數(shù)顯調(diào)速搖床，YC-96，常州市天境實(shí)驗(yàn)儀器廠;ScoutSE電子天平，YP402N,奧豪斯儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，TG18-WS，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司;高通量全自動(dòng)固相萃取儀，F(xiàn)otector Plus-60，美國睿科儀器有限公司;水浴氮吹儀，NDK-12W,上海皓莊儀器有限公司；250 mL具塞三角瓶；實(shí)驗(yàn)室清洗消毒機(jī)，G7883,德國美諾。

1.2 試劑

色譜級(jí)甲醇、乙腈，迪馬科技；超純水，由沃特浦純水機(jī)生產(chǎn)，四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司。

真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW(E)100304)質(zhì)量濃度為 100 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液；質(zhì)量濃度分別為100 ng/mL、200ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、5000 ng/mL。

提取液：超純水。

免疫親和柱：Evergreen TREA嘔吐毒素免疫親和柱3 mL。

1.3 色譜條件

色譜柱：安捷倫-C18,4.6 mm×250 mm(5 μm)；

流動(dòng)性：20%的甲醇；

流速：1.0 mL/min；

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，波長218 nm；

進(jìn)樣體積：30 μL；

柱溫：35℃。

1.4 優(yōu)化條件的確定

1.4.1 分樣不均勻?qū)Y(jié)果的影響

以小麥樣品中DON限量點(diǎn)的100%加標(biāo)，即含量為1 000 μg/kg。對(duì)同一個(gè)顆粒樣品進(jìn)行2次與4次分樣的比對(duì)，然后粉碎。按照GB 5009.111-2016的提取方法進(jìn)行測(cè)定，得到DON的不均勻性非常大，分樣不均勻做的試驗(yàn)的誤差較大，分樣次數(shù)越多雙試驗(yàn)誤差越小。所以做樣之前要對(duì)樣品進(jìn)行充分地混合，否則誤差大，結(jié)果不準(zhǔn)確。結(jié)果見表1。

1.4.2 稱樣量的大小對(duì)結(jié)果的影響

以小麥樣品中DON限量點(diǎn)的100%加標(biāo)，即含量為1 000 μg/kg。對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行稱樣量的不同進(jìn)行比對(duì)，按照GB 5009.111-2016的提取方法進(jìn)行測(cè)定，分別稱取 5.00 g、12.50 g、25.00 g三種梯度進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)論表明：稱樣量越大雙實(shí)驗(yàn)的誤差越小，結(jié)果越準(zhǔn)確。結(jié)果見表2。

表2 不同稱樣量各水平的含量

1.4.3 相同振蕩頻率不同的振蕩時(shí)間、相同振蕩時(shí)間不同的振蕩頻率對(duì)結(jié)果的影響

以小麥樣品中DON限量點(diǎn)的100%加標(biāo)，即含量為1 000 μg/kg。對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行相同頻率不同時(shí)間、相同時(shí)間不同頻率進(jìn)行比對(duì)，按照GB 5009.111-2016的提取方法進(jìn)行測(cè)定。由表3和表4兩組數(shù)據(jù)可得出DON提取方法最佳的振蕩頻率為200 r/min，振蕩時(shí)間為20 min。

表3 振蕩頻率200 r/min時(shí)不同的時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響

表4 振蕩頻率230 r/min不同的時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響

1.4.4 氮吹溫度對(duì)結(jié)果的影響

以小麥樣品中DON限量點(diǎn)的100%加標(biāo)，即含量為1 000 μg/kg。對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，按照GB 5009.111-2016的提取方法進(jìn)行測(cè)定，最后一步一個(gè)樣品用50℃的氮吹，另一個(gè)樣品用60℃氮吹。得出結(jié)論：用50℃氮吹所用時(shí)間為20 min左右，用60℃氮吹所用時(shí)間為10 min左右，通過表5可知60℃與50℃回收率基本一致，60℃可以節(jié)省時(shí)間，也可以節(jié)省成本。故60℃為最佳氮吹溫度。

表5 不同的氮吹溫度對(duì)結(jié)果的影響

1.4.5 不同的定容溶液對(duì)結(jié)果的影響

以小麥樣品中DON限量點(diǎn)的100%加標(biāo)，即含量為1 000 μg/kg。對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，按照GB 5009.111-2016的提取方法進(jìn)行測(cè)定，最后一步一個(gè)樣品用20%的甲醇定容，另一個(gè)樣品用10%的乙腈定容。得出結(jié)論：不同的定容溶液對(duì)結(jié)果影響不是太大，用兩個(gè)溶液都是可以的，為了跟流動(dòng)相一致，選用20%的甲醇最佳。結(jié)果見表6。

表6 不同的定容溶液對(duì)結(jié)果的影響

1.4.6 優(yōu)化條件結(jié)論

小麥DON測(cè)定試驗(yàn)中，首先分樣必須均勻，稱樣量要大于25.00 g,振蕩頻率為200 r/min振蕩時(shí)間為20 min,最后用60℃氮?dú)獯蹈?，?0%的甲醇定容為最終的試驗(yàn)條件。

1.5 提取與凈化

1.5.1 提取方法

原始樣品經(jīng)研磨粉碎、過篩，使其粒徑小于0.5～1 mm，混勻備用。

分別準(zhǔn)確稱取25.00 g(精確到0.01 g)磨碎的試樣于250 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇8000，加超純水100 mL，混勻，置于搖床中200r/min振蕩20 min。以6 000 r/min下離心10 min，收集濾液于干凈的容器中。

1.5.2 凈化方法

取2 mL上述上清液到固相萃取儀，操作步驟如表7：

表7 Fotector Plus脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和凈化方法

最后，在60℃下用氮?dú)獯蹈上疵撘?，加?mL20%甲醇定容，混勻后利用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和線性范圍

在上述色譜條件下，DON的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1所示。

圖1 DON的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液做線性回歸分析，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)得到DON線性方程和相關(guān)系數(shù)，Y=0.03843263X+0.2240615，R2=0.99996，線性范圍 100～5 000 ng/mL，DON 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 樣品的加標(biāo)回收測(cè)定

2.2.1 樣品加標(biāo)色譜圖

本試驗(yàn)以小麥DON限量為基準(zhǔn)，分別向3組樣品中添加DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，其添加水平分別是500μg/kg、1 000 μg/kg、2 000 μg/kg， 每組樣品做 3個(gè)平行試驗(yàn)。小麥空白基質(zhì)及加標(biāo)樣品色譜圖分別見圖 3、圖 4、圖 5、圖 6。

圖3 小麥空白基質(zhì)色譜圖

圖4 小麥DON的加標(biāo)量為500 μg/kg色譜圖

圖5 小麥DON的加標(biāo)量為1 000 μg/kg色譜圖

圖6 小麥DON的加標(biāo)量為2 000 μg/kg色譜圖

2.2.2 回收率試驗(yàn)

向小麥基質(zhì)中添加DON標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其含量為500 μg/kg、1 000 μg/kg、2 000 μg/kg，三組平行加標(biāo)回收率結(jié)果見表8：

按照此方法做了玉米、大豆、玉米粉及小麥粉的DON加標(biāo)回收試驗(yàn)，DON的回收率（%）見表9。

3 結(jié)論

本文主要對(duì)糧食中DON的提取和凈化方法進(jìn)行了比對(duì)、研究。在GB 5009.111-2016中DON提取凈化的基礎(chǔ)上結(jié)合試驗(yàn)中的具體操作進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，最終按照DON的優(yōu)化改進(jìn)提取方法得到了最佳的回收率。本方法效果好、可靠、準(zhǔn)確度和精密度高，能夠運(yùn)用于糧食中DON的檢測(cè)工作，滿足分析要求，有一定的參考應(yīng)用價(jià)值。