成體干細(xì)胞治療皮膚損傷性疾病的研究進(jìn)展▲

陳 濤 馮高科 易 欣 蔣學(xué)俊

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科、武漢大學(xué)心血管病研究所、心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：1275793102@qq.com)

【提要】 干細(xì)胞是一類具有自我更新、分化能力的多潛能細(xì)胞。近年來(lái)，成體干細(xì)胞在皮膚創(chuàng)傷治療中的應(yīng)用備受關(guān)注，主要用于治療糖尿病皮膚潰瘍、靜脈潰瘍、遺傳性皮膚病等。本文就成體干細(xì)胞在皮膚損傷性疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

皮膚是全身最大的器官，也是最容易損傷的器官，其在熱失調(diào)、抵抗機(jī)械力和感染等方面發(fā)揮重要作用。多種原因可導(dǎo)致皮膚傷口愈合延遲，其中糖尿病皮膚潰瘍、靜脈潰瘍、部分遺傳性皮膚病等難愈性創(chuàng)傷仍缺乏有效的治療手段[1-2]。干細(xì)胞是一類具有自我更新、分化能力的多潛能細(xì)胞[3]。近年來(lái)，干細(xì)胞在皮膚創(chuàng)傷治療中的應(yīng)用備受關(guān)注。用于損傷皮膚組織修復(fù)和再生的干細(xì)胞主要是胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞(somatic stem cell，SSC)兩大類[4]。胚胎干細(xì)胞雖然存在自我更新能力，但其來(lái)源不足且倫理問(wèn)題突出[5]，因此，研究者們逐漸將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向SSC。SSC主要包括表皮干細(xì)胞(epidermal stem cell，ESC)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，ADSC)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞等[4]。本文就SSC在皮膚損傷性疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ESC

皮膚表皮細(xì)胞的持續(xù)更新和損傷后再生修復(fù)能力取決于表皮基底層的ESC，ESC是表皮增殖單元的核心[6]。哺乳動(dòng)物皮膚表皮由濾泡間細(xì)胞和相關(guān)附件(毛囊、皮脂腺和汗腺)組成，每個(gè)部位都有相應(yīng)的干細(xì)胞群[7-8]。當(dāng)皮膚受損時(shí)，與其相鄰的未受損毛囊或皮脂腺中的干細(xì)胞發(fā)生遷移，對(duì)損傷皮膚進(jìn)行修復(fù)，而影響干細(xì)胞遷移的因素均可間接影響皮膚損傷的修復(fù)[9]。皮膚傷口愈合的主要階段包括炎癥、增殖、再上皮化、血管生成、重塑和瘢痕形成等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在前緣角化細(xì)胞上表達(dá)的新整合素以及肌動(dòng)蛋白交聯(lián)因子7在促進(jìn)細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用[10]。Alcolea等[6]研究表明，創(chuàng)面邊緣的趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)水平明顯升高，ESC表達(dá)并促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子受體4(CXC趨化因子受體4，CXC chemokine receptor type 4，CXCR-4)增殖，阻斷SDF-1/CXCR-4通路后，表達(dá)SDF-1的ESC明顯減少，導(dǎo)致傷口愈合延遲，而外用SDF-1可促進(jìn)傷口愈合。

目前ESC的臨床應(yīng)用主要體現(xiàn)在自體表皮培養(yǎng)移植術(shù)(cultured epidermal autograft，CEA)。與傳統(tǒng)的自體皮膚移植相比，CEA使用的移植物主要是從自體皮膚組織中分離并在體外生物材料上培育的表皮移植體，這些分離培養(yǎng)物中富含ESC，可以解決自體供皮不足的問(wèn)題，避免二次創(chuàng)口形成[11-12]。Kadoya等[13]對(duì)不同程度燒傷患者進(jìn)行燒傷瘢痕切除和CEA，結(jié)果顯示皮膚傷口可持續(xù)愈合且正常表皮化。Akita等[14]對(duì)大面積燒傷患者進(jìn)行高度擴(kuò)張的皮膚移植輔以CEA治療，術(shù)后6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)患者擴(kuò)張的皮膚移植可以最大限度地減少供體需求和瘢痕形成。然而，CEA在體外需要較長(zhǎng)的培育時(shí)間，且對(duì)培養(yǎng)設(shè)備要求高，成本昂貴。此外，接受CEA治療的患者感染風(fēng)險(xiǎn)更高，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致移植失敗。其原因主要是CEA移植物灌注不足，因此，如何加強(qiáng)創(chuàng)面血液灌注和增強(qiáng)患者免疫力仍有待進(jìn)一步研究[12]。

2 BMSC

間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)和體外均具備分化潛能，是治療皮膚損傷的重要細(xì)胞[15-16]。最早發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于骨髓組織，BMSC易于獲取和培養(yǎng)，具有多向分化潛能，免疫原性低，是目前皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中主要的異體細(xì)胞種類[17]。

Fang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC通過(guò)旁分泌信號(hào)通路抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，降低增生性瘢痕成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、纖溶酶原激活物抑制因子1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2的表達(dá)水平，使抗纖維化因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3和蛋白核心聚糖的表達(dá)顯著增強(qiáng)，從而抑制纖維化進(jìn)程。Zheng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC可以分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、SDF-1和前列腺素E2，抑制炎癥反應(yīng)，增加細(xì)胞趨化性與增殖能力，抑制纖維化及瘢痕形成，從而治療輻射誘導(dǎo)的急性皮膚損傷。BMSC和破骨細(xì)胞是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b超家族成員激活素的主要來(lái)源，激活素B為激活素的主要形式之一，BMSC表面高度表達(dá)激活素B受體，激活素B可誘導(dǎo)BMSC內(nèi)肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維的形成，并通過(guò)c-Jun氨基末端激酶細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)傷口愈合，減少纖維瘢痕的形成[20]。

單純將BMSC注射入皮膚受損區(qū)域無(wú)法克服灌注不足、瘢痕形成等問(wèn)題，而將分離培養(yǎng)后的BMSC種植到三維凝膠海綿支架上，可以促進(jìn)血管生成，減少組織空洞形成，從而提高移植療效[21]。通過(guò)基因工程技術(shù)將載有人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165和人-防御素3基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大鼠BMSC，可促進(jìn)其旁分泌作用，縮短傷口愈合時(shí)間，減少肉芽組織的形成與膠原的沉積，說(shuō)明該療法在治療放射性創(chuàng)傷等難治性創(chuàng)面中具有良好的應(yīng)用前景[22]。

3 ADSC

ADSC除了能夠分化成為內(nèi)皮細(xì)胞和血管細(xì)胞，具有促進(jìn)血管新生的潛力外，還能夠通過(guò)旁分泌功能加速傷口愈合[24]。因此，近十年來(lái)ADSC在促進(jìn)傷口愈合中的潛在作用備受關(guān)注。

ADSC具有與BMSC類似的分泌特性，能夠從脂肪組織中通過(guò)低侵入性操作大量獲取，每克皮下脂肪組織中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量是骨髓的500倍[25-26]。外泌體是ADSC重要的旁分泌因子之一，在皮膚損傷愈合過(guò)程中，ADSC來(lái)源的外泌體通過(guò)激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和遷移，優(yōu)化膠原沉積，進(jìn)一步加速損傷愈合[27]。體外培育的ADSC可表達(dá)脂聯(lián)素和瘦素[28]，與人真皮成纖維細(xì)胞相互結(jié)合，顯著增加透明質(zhì)酸和膠原蛋白的生成，促進(jìn)皮膚傷口愈合[29]。缺氧條件下體外培養(yǎng)的ADSC能顯著促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞的膠原合成和遷移，與正常氧條件下體外培養(yǎng)相比，缺氧條件下培養(yǎng)的ADSC可明顯減少傷口面積，促進(jìn)VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，使用中和抗體抑制VEGF和bFGF可抑制人真皮成纖維細(xì)胞的遷移和皮膚傷口愈合[30-31]。臨床上在自體富血小板血漿中培養(yǎng)ADSC有助于移植后脂肪細(xì)胞的增殖和ADSC的分化，能促進(jìn)大量生長(zhǎng)因子生成如VEGF、血小板源性生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等[26]表達(dá)。

目前利用ADSC治療皮膚相關(guān)疾病的安全性、持久性仍有待進(jìn)一步研究，如ADSC作為可溶性因子分泌載體的具體作用機(jī)制、供體年齡是否影響ADSC的潛力等，不斷對(duì)ADSC在皮膚再生和創(chuàng)傷愈合中的功能機(jī)制進(jìn)行深入研究，對(duì)于尋找治療皮膚損傷疾病新靶點(diǎn)具有很大前景。

4 人羊膜上皮細(xì)胞

人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cell，hAEC)是圍生期產(chǎn)生的具有胚胎干細(xì)胞樣分化能力和SSC樣免疫調(diào)節(jié)功能的干細(xì)胞之一，可促進(jìn)傷口愈合[32]。Zheng等[33]在糖尿病小鼠全層切除性皮膚傷口周圍皮下注射hAEC，結(jié)果顯示hAEC可分泌白介素13等促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，增加損傷區(qū)域毛細(xì)血管密度。Zhao等[34]研究發(fā)現(xiàn)，hAEC可通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、c-Jun氨基末端激酶和蛋白激酶B信號(hào)通路調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合；此外，與hAEC共培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞可上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白D3和雙微體2癌基因的表達(dá)，通過(guò)激活有絲分裂加速組織的修復(fù)過(guò)程。體外傷口局部注射hAEC可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移和增殖，促進(jìn)金屬蛋白酶1的表達(dá)，抑制以Ⅰ型膠原蛋白Ⅰ、Ⅰ型膠原蛋白Ⅲ為主的細(xì)胞外基質(zhì)生成，加速皮膚傷口愈合并抑制瘢痕形成[32]。與ADSC的旁分泌作用相比，hAEC分泌表皮生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子B等生長(zhǎng)因子的水平更高，提示hAEC可能具有比ADSC更顯著的治療皮膚損傷效果[35]。Zou等[36]研究發(fā)現(xiàn)，與干細(xì)胞多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Oct4、泛素連接酶2和Nanog基因的表達(dá)水平隨體外培養(yǎng)的傳代次數(shù)增加而降低，泛素連接酶2可能被激活并與Oct4蛋白結(jié)合，從而引發(fā)泛素化和降解，導(dǎo)致Oct4蛋白表達(dá)缺失和干細(xì)胞多能性降低；microRNA-32通過(guò)抑制泛素連接酶2的表達(dá)，抑制泛素化和凋亡，從而維持體外hAEC培養(yǎng)物中干細(xì)胞多能性。因此，hAEC具有干細(xì)胞樣可塑性和雙重免疫調(diào)節(jié)特性，易大量獲取，遺傳穩(wěn)定，且不涉及醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題，是干細(xì)胞的理想替代來(lái)源，將成為臨床治療糖尿病基礎(chǔ)傷口和其他慢性創(chuàng)傷的有效方法[5，32]。

5 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞

隨著對(duì)干細(xì)胞的進(jìn)一步研究，通過(guò)將體細(xì)胞與四種轉(zhuǎn)錄因子(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc或Oct4/Sox2/Nanog/Lin28)結(jié)合，可以誘導(dǎo)體細(xì)胞向誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)轉(zhuǎn)化，使得iPSC成為再生醫(yī)學(xué)研究和細(xì)胞治療中最普遍和易獲得的細(xì)胞來(lái)源[37]。在糖尿病潰瘍小鼠模型的皮膚損傷研究中，iPSC源性外泌體可以直接作用于細(xì)胞，促進(jìn)糖尿病小鼠皮膚成纖維細(xì)胞遷移和增殖，并增加血管密度[38]。此外，iPSC容易進(jìn)行基因改造，因此在治療遺傳性皮膚病方面具有廣泛的應(yīng)用前景。分離患者皮膚細(xì)胞進(jìn)行基因重組使之轉(zhuǎn)化為iPSC，并對(duì)同源重組獲得的iPSC突變進(jìn)行修復(fù)，誘導(dǎo)其分化為所需的細(xì)胞類型，最后進(jìn)行自體移植可達(dá)到治療效果[39]。隱性遺傳營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥是一種編碼Ⅶ型膠原的COL7A1基因突變引起的遺傳性水皰性疾病，Itoh等[40]從該類患者皮膚中成功分離出纖維細(xì)胞，證明自體iPSC有潛力為遺傳性皮膚病的再生治療提供細(xì)胞來(lái)源；然而，通過(guò)iPSC矯正COL7A1基因潛在的遺傳缺陷是否適用于該病所有患者，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

iPSC治療皮膚相關(guān)疾病還存在一定的局限性，比如現(xiàn)有的細(xì)胞純化技術(shù)尚不能完全成功地將分化細(xì)胞從未分化的iPSC中分離出來(lái)，而未分化的iPSC移植后會(huì)增加腫瘤或畸胎瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)；還有基因重編效率低，重編過(guò)程對(duì)細(xì)胞基因組完整性的影響程度尚不清楚，iPSC可能會(huì)導(dǎo)致基因組異常等[39]。因此，iPSC真正用于臨床治療還有待進(jìn)一步深入研究。

6 總 結(jié)

綜上所述，進(jìn)一步研究各類干細(xì)胞參與皮膚損傷愈合修復(fù)以及恢復(fù)受干擾的皮膚穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制，對(duì)尋找更確切有效、廣泛適用的皮膚損傷治療策略具有十分重要的意義。針對(duì)慢性傷口及瘢痕傷口等難愈合傷口的治療，分離純化各類干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，優(yōu)化體外培育干細(xì)胞方案，以及設(shè)計(jì)更優(yōu)的培育支架載體和降低臨床應(yīng)用成本，均是未來(lái)研究的重點(diǎn)。