濁點(diǎn)萃取-紫外分光光度法測(cè)定知母藥材中鐵元素含量

李妹珍，陳鋒燁，馮毅凡，吳 霞

(廣東藥科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

知母(AnemarrhenaeRhizoma) 為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.) 的干燥根莖，味苦，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，知母具有清熱、抗炎、抗感染、抗腫瘤、抗真菌等多種藥理活性[1-2]。知母根莖中含有大量甾體皂苷、雙苯吡酮類、黃酮類、木質(zhì)素類、生物堿類、多糖類、有機(jī)酸類及微量元素等[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)知母的活性成分研究逐漸深入，許多從知母根莖中分離出來(lái)的成分具有極大的藥用價(jià)值，如皂苷、雙苯吡酮等[3]，但關(guān)于知母根莖中微量金屬元素的研究卻很少。值得注意的是，很多中藥材的寒涼溫?zé)釋傩砸约八幮幮缘染c其含有的微量金屬元素有關(guān)[4-5]。

濁點(diǎn)萃取是近年來(lái)新興的用來(lái)分離富集痕量元素的液-液萃取技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、萃取效率高、富集因子大、不使用有毒有害的有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)，是環(huán)境友好型方法。其易于與其他分析技術(shù)聯(lián)用，如紫外可見(jiàn)分光光度法、反相高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法及流動(dòng)注射分析等[6-11]，可實(shí)現(xiàn)金屬元素及其他樣品的分離、富集以及測(cè)定等，自問(wèn)世以來(lái)便得到廣泛應(yīng)用。知母根莖中的微量元素鐵是人體所必需的十多種微量元素中居于首位的元素，是合成人體血紅蛋白的重要原料之一，也是知母清熱瀉火、生津潤(rùn)燥的基礎(chǔ)藥效物質(zhì)之一[12-14]。因此，本文運(yùn)用濁點(diǎn)萃取-紫外分光光度計(jì)法結(jié)合濕法消解測(cè)定知母中鐵元素含量，為其后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

知母產(chǎn)自河北，購(gòu)自廣州致信藥業(yè)有限公司，由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.) 的干燥根莖。無(wú)水乙醇、正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑廠)；正癸醇(分析純，上海阿拉丁試劑)；Triton X-100(分析純，上海MACKLIN)；硝酸、鹽酸、硫酸、30%過(guò)氧化氫(廣州化學(xué)試劑廠)。

1.2 儀器

S220 pH計(jì)(瑞士Metter Toledo公司)；GH-252 0.01 mg電子天平(日本AND公司)；Fresco17離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；DU-800紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；DB-3不銹鋼電熱板(江蘇金壇市宏華儀器廠)；DL-400A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；DFY-500高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取0.212 20 g硫酸鐵銨，加入10 mL 50%硫酸水溶液，超聲5 min。轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，制成鐵離子儲(chǔ)備液。精密移取10 mL儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，制成鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液。

濁點(diǎn)萃取標(biāo)準(zhǔn)液中的鐵元素：準(zhǔn)確移取鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL至15 mL帶刻度離心管中，依次加入2.2 mL 0.5 mol/L KSCN溶液，0.6 mL 5% Triton X-100溶液，0.1 mL 5%硫酸溶液，2.2 mL 正己醇。震蕩，加入去離子水補(bǔ)足至10 mL，于30℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)10 min。4 000 rpm下離心5 min，使溶液分相完全，用巴氏吸管小心吸去下層水相，準(zhǔn)確加入2.0 mL無(wú)水乙醇稀釋剩余有機(jī)相，混勻。待測(cè)。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 濕法消解知母藥材 用粉碎機(jī)粉碎適量知母藥材至細(xì)粉末。分別稱取3份知母藥材粉末樣品于錐形瓶中，標(biāo)記為A、B、C。其中A：1.004 g；B：1.004 g；C：0.998 g。分別加入20 mL濃硝酸過(guò)夜預(yù)消解，置于電熱板上加熱至不冒黃煙。取下靜置至室溫，加入5 mL過(guò)氧化氫溶液，繼續(xù)加熱消解。待剩下少量溶液，再分3次補(bǔ)加共約30 mL過(guò)氧化氫溶液。加熱一段時(shí)間后，溶液澄清透明無(wú)色，加適量水趕酸，繼續(xù)加熱消解至剩下約1 mL溶液，取下靜置至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，制成A、B、C三組待萃取樣品溶液。

2.2.2 濁點(diǎn)萃取知母消解液中的鐵元素 移取1.5 mL A、B、C待萃取樣品溶液，余下步驟同“2.1”項(xiàng)下方法得A、B、C供試品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精確吸取經(jīng)過(guò)濁點(diǎn)萃取處理的鐵標(biāo)準(zhǔn)液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，相應(yīng)的鐵離子濃度見(jiàn)表1，在波長(zhǎng)λ=497 nm下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。鐵離子濃度在1.0～2.8 μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：A=0.153 5c-0.017 3，r=0.999 2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)液濃度

圖1 鐵離子濃度與吸光度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品樣品，測(cè)定鐵含量后，分別在1、2、4、8、12、24 h再次測(cè)定吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖2。待測(cè)樣品室溫放置1 h后，A、B、C三組吸光度僅下降0.1%～0.7%；而室溫放置24 h后A、B兩組樣品吸光度分別下降8.2%、9.8%，但C組24 h吸光度異常上升，有可能是實(shí)驗(yàn)操作問(wèn)題，數(shù)據(jù)舍去。由此可推斷，樣品在配制到測(cè)定完成的30 min左右吸光度下降可以忽略，溶劑穩(wěn)定性強(qiáng)，對(duì)結(jié)果影響可忽略。

圖2 供試品樣品不同時(shí)間點(diǎn)顯色吸光度

2.4.2 鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色穩(wěn)定性 酸對(duì)減緩樣品褪色現(xiàn)象有積極作用。本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定2組用鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的樣品，第1組不加酸，第2組加0.1 mL 5%硫酸，每隔10～15 min測(cè)定其吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖3。第2組加酸的樣品在40 min時(shí)吸光度僅下降2.53%；而第1組不加酸的樣品在20 min時(shí)吸光度就下降了6.37%，在40 min時(shí)下降了13.43%。由此可推測(cè)，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)加入適量的酸能有效提高溶液的顯色穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)要求在40 min內(nèi)完成測(cè)定，對(duì)結(jié)果無(wú)影響。

圖3 鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液不同時(shí)間點(diǎn)顯色吸光度

2.4.3 加標(biāo)回收率測(cè)定 按照“2.1”項(xiàng)下方法配制100 mg/L的鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液母液，移取7 mL至100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，得7 mg/L的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取A、B、C三組經(jīng)濁點(diǎn)萃取的待測(cè)樣品溶液0.750 mL，以及相當(dāng)于當(dāng)量Fe元素的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(7 mg/L)，加入離心管中，以空白消解液為參比，在波長(zhǎng)λ=497nm下測(cè)定各待測(cè)樣品溶液的吸光度，每組樣品平行測(cè)定2份。所得結(jié)果見(jiàn)表2。測(cè)定6次，樣品加標(biāo)回收率均在95%～105%范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率良好，表明在最佳測(cè)定條件下，F(xiàn)e元素能夠充分顯色并被萃取出來(lái)；RSD值為2.74%，說(shuō)明此最佳條件下濁點(diǎn)萃取法的重現(xiàn)性良好。

2.5 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

以空白試劑作為參比，在波長(zhǎng)400～800 nm范圍內(nèi)對(duì)Fe3+-SCN--Triton X-100絡(luò)合物體系進(jìn)行光譜掃描，以確定體系最佳吸收波長(zhǎng)。結(jié)果表明，該體系在497 nm處吸光度最大，因此選擇497 nm波長(zhǎng)測(cè)定該絡(luò)合物體系。

2.6 紫外分光光度計(jì)測(cè)定知母消解液中的鐵元素含量

取A、B、C三組供試品溶液，分別加入2 mL離心管中，13 000 rpm離心5 min。精確吸取上清液1.5 mL加入離心管中，以空白消解液為參比，在波長(zhǎng)λ=497 nm下測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，每1 g知母藥材中含有Fe元素170.8 μg，RSD值為3.67%，表明結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 樣品Fe含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

濁點(diǎn)萃取雖然運(yùn)用廣泛，但其作用原理尚不明確，目前普遍認(rèn)為是當(dāng)體系溫度時(shí)，表面活性劑的膠束尺寸變大，氫鍵的結(jié)合力不足以保持水分子連接在醚的氧原子，隨著溫度的升高，表面活性劑極性基團(tuán)水化層被破壞，從而導(dǎo)致膠束內(nèi)斥力降低和膠束聚集體劇增，溶液出現(xiàn)渾濁和相分離，該溫度被稱為濁點(diǎn)溫度，由于膠束體積小，所以起到了富集作用[6,15]。

在濁點(diǎn)萃取中，濁點(diǎn)溫度是影響萃取效率以及溶液體系顯色穩(wěn)定性的最重要的參數(shù)之一。影響濁點(diǎn)溫度的因素有很多，本文考察了不同種類的醇(正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正癸醇)及用量(1.0～2.4 mL)對(duì)濁點(diǎn)萃取效果的影響，結(jié)果表明2.2 mL正己醇對(duì)1.5 mL知母消解液的萃取效果較好。同時(shí)對(duì)表面活性劑 Triton X-100(0～2.4 mL)和顯色劑KSCN(1.0～2.8 mL)的用量、平衡溫度(25～60℃)與平衡時(shí)間(0～40 min)、pH(有無(wú)加入5%硫酸)進(jìn)行了考察，確定了濁點(diǎn)萃取的最佳條件，即1.5 mL知母消解液，2.2 mL 0.5 mol/L KSCN作為顯色劑；0.6 mL 5% Triton X-100作為表面活性劑；2.2 mL正己醇作為有機(jī)相；0.1 mL 5%H2SO4調(diào)節(jié)pH=1～2以保持體系穩(wěn)定；體系平衡溫度30 ℃，平衡時(shí)間10 min。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究借助濕法消解知母藥材，運(yùn)用濁點(diǎn)萃取法萃取出消解液中的鐵元素并采用紫外分光光度法測(cè)定其含量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了濕法消解、濁點(diǎn)萃取及紫外分光光度法的最佳條件，測(cè)得知母藥材中鐵元素含量為170.8 μg/g。本實(shí)驗(yàn)建立了基于濕法消解知母藥材結(jié)合濁點(diǎn)萃取-紫外分光光度法，簡(jiǎn)單、高效、快速地測(cè)定知母藥材中鐵元素含量，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，為知母的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。