柴黃清胰活血顆粒對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肝腎損害的保護(hù)作用

呂 瑤,肖國(guó)輝,王天剛,陳珊珊,趙 龍

（西南醫(yī)科大學(xué)：1中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院；2附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，四川瀘州 646000）

作為消化系統(tǒng)的危急重癥之一，重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)的病因與診治經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)期的探索，盡管近年來(lái)其病死率明顯下降，但我們對(duì)其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未完全明確，治療也是臨床上的一大難點(diǎn)；因其不僅是胰腺自身的炎癥，更是引起全身多個(gè)臟器損害的全身性疾病，可引起多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syn?drome，MODS)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic in?flammatory response syndrome，SIRS)等。SAP 發(fā)病過(guò)程中多并發(fā)肝腎損害，且發(fā)生較早。Halonen 等[1]在一項(xiàng)回顧性研究中發(fā)現(xiàn)：重癥急性胰腺炎并發(fā)肝損傷的比率很高，達(dá)88.9%，并且以肝、腎功能衰竭最為嚴(yán)重，死亡率最高。柴黃清胰活血顆粒具有瀉熱通腑、清熱解毒、行氣止痛、活血化瘀的功效。其臨床療效明確，前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，柴黃清胰活血顆粒對(duì)重癥急性胰腺炎模型大鼠有明顯的治療作用[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討柴黃清胰活血顆粒對(duì)重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺及胰外器官（肝、腎）的治療作用，為該藥的臨床運(yùn)用和新藥研究提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD 大鼠54 只，10 周齡，體重為280～320 g[購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及劑量

柴黃清胰活血顆粒主要由生大黃、柴胡、黃芩、梔子、枳實(shí)、厚樸、桃仁、赤芍、蒲公英等十四味組成，成藥由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室研制提供。批號(hào):20181015。按照公式：大鼠劑量（g/kg）=W×人體劑量（g/kg）,W=6.25，成年人體重取60 kg，一次10 g,換算得出：大鼠常規(guī)使用劑量為：0.1 g/100 g,根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)：柴黃清胰活血顆粒療效呈劑量依賴性，其中高劑量組療效更好，本次實(shí)驗(yàn)直接采用高劑量（0.2 g/100 g）作為中藥組（CHQY 組）使用劑量[1]。

1.3 試劑

牛磺膽酸鈉(Solarbio 公司，批號(hào):20171113)，配制成3.5%?；悄懰徕c溶液。蘇木素染液(北京百靈威科技有限公司，批號(hào)：20160114)，4%多聚甲醛中性固定液（biosharp公司,批號(hào)：1810473）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為3 個(gè)組，即sham 組、SAP 組、CHQY 組，每組分為6 h、12 h、24 h三個(gè)時(shí)點(diǎn)，每個(gè)時(shí)點(diǎn)6 只，術(shù)前禁食12 h,自由飲水。Sham 組開(kāi)腹后僅翻動(dòng)腸管即關(guān)閉腹腔。SAP 組及CHQY組采用經(jīng)十二指腸逆行胰膽管注射3.5%牛磺膽酸鈉建立重癥急性胰腺炎模型。具體方法：大鼠稱重，用3%戊巴比妥鈉液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后固定于手術(shù)臺(tái)，腹部剃毛，消毒,鋪巾，沿腹部正中線劍突下作1條長(zhǎng)約3 cm 手術(shù)切口開(kāi)腹，找到十二指腸及胰腺，用動(dòng)脈夾夾閉肝總管防止?；悄懰徕c進(jìn)入肝臟，用4.5號(hào)磨鈍皮試針頭沿十二指腸乳頭對(duì)側(cè)十二指腸偏下方無(wú)血管區(qū)緩慢進(jìn)入胰膽管，動(dòng)脈夾夾閉針頭入胰膽管處防止反流，緩慢勻速注射?；悄懰徕c（0.1 mL/100 g）,注射完畢后取出動(dòng)脈夾并逐層關(guān)腹，術(shù)后予以皮下注射生理鹽水（4 mL）補(bǔ)充術(shù)中失水，術(shù)后予以保暖。麻醉蘇醒后，Sham 組與SAP 組予以灌胃生理鹽水（1 mL/100 g）,CHQY組予以灌胃柴黃清胰活血顆粒（0.2 g/100 g，并用生理鹽水稀釋為1 mL/0.2 g），每組每4 h灌胃1次。

1.5 標(biāo)本采集

分別在術(shù)后6 h、12 h、24 h各處死6只大鼠并取材，取腹主動(dòng)脈血約3～5 mL，靜置1 h后離心，取血清存于-20 ℃冰箱以備檢測(cè)AMS、AST、ALT、Scr、BUN；分別取胰腺、肝、腎，用冰生理鹽水沖洗后迅速放入4%多聚甲醛固定液中固定，以備HE染色，行病理檢查。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

血清AMS、AST、ALT、Scr、BUN均由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。胰腺、肝、腎組織進(jìn)行組織脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色、樹(shù)膠封片，最后在光鏡下觀察，進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。胰腺病理評(píng)分采用Rongione評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]：按照水腫、炎癥浸潤(rùn)、出血、壞死四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)方面根據(jù)嚴(yán)重程度分別評(píng)0分、1分、2分、3 分、4 分。肝、腎病理評(píng)分參考田在善[4]的標(biāo)準(zhǔn)，按嚴(yán)重程度分為正常、輕、中、重，分別評(píng)0 分，1 分，2分，3分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清淀粉酶活性變化

與Sham 組相比，SAP 組及CHQY 組在各個(gè)時(shí)點(diǎn)血清淀粉酶活性均顯著升高（P＜0.05）；與SAP組比較，CHQY 組6 h 組淀粉酶活性無(wú)差異，12 h、24 h 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶比較(±s，U/L)

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶比較(±s，U/L)

注：a與Sham組相比，P＜0.05；b與SAP組相比，P＜0.05

2.2 大鼠血清AST、ALT活性變化

與Sham 組各時(shí)點(diǎn)比較，SAP 組、CHQY 組AST、ALT活性均明顯升高（P＜0.05），CHQY組12 h、24 h與SAP 組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較，血清ALT 水平明顯降低(P＜0.05)。與SAP 組比較，CHQY 組各時(shí)點(diǎn)AST 水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

表2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清AST、ALT比較(±s，U/L)

表2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清AST、ALT比較(±s，U/L)

注：a與Sham組相比，P＜0.05；b與SAP組相比，P＜0.05

2.3 大鼠血清BUN、Scr活性變化

與Sham 組各時(shí)點(diǎn)比較，SAP 組、CHQY 組BUN、Scr 活性均明顯升高（P＜0.05），CHQY 組12 h、24 h與SAP 組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較，血清BUN 水平明顯降低（P＜0.05）。與SAP 組比較，CHQY 組各時(shí)點(diǎn)Scr 水平均降低（P＜0.05）。（見(jiàn)表3）

表3 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清BUN、Scr比較(BUN:±s，mmol/L，n=6;Scr:±s，μmol/L)

表3 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清BUN、Scr比較(BUN:±s，mmol/L，n=6;Scr:±s，μmol/L)

注：a與Sham組比較，P＜0.05；b與SAP組比較，P＜0.05

2.4 剖腹后大體觀察

Sham組各時(shí)點(diǎn)大鼠腹腔無(wú)明顯積液，腸腔無(wú)充氣，胰腺無(wú)充血、水腫及壞死，未見(jiàn)皂化斑，胰腺與周圍組織輕微粘連。SAP組各時(shí)點(diǎn)大鼠腹腔大量紅黃色積液，腸管腫脹充血，胰腺腫脹、壞死、充血，胰腺及腹腔網(wǎng)膜可見(jiàn)大量黃白色皂化斑，胰腺與肝、脾、腸管粘連明顯，且隨時(shí)間的推移加重。CHQY 組各時(shí)點(diǎn)腹腔積液較SAP組減少，胰腺腫脹、充血較SAP組有所減輕，胰腺周圍及網(wǎng)膜可見(jiàn)少量皂化斑，胰腺與周圍器官組織粘連。

2.5 胰腺病理組織學(xué)觀察

Sham組各時(shí)點(diǎn)大鼠胰腺除個(gè)別有輕度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，大部分胰腺結(jié)構(gòu)基本完整，未見(jiàn)水腫、出血、壞死（見(jiàn)圖1）。SAP 組大鼠胰腺水腫，胰腺腺泡壞死，小葉結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)分隔小葉，胞漿內(nèi)可見(jiàn)空泡形成，壞死區(qū)周圍可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)；胰腺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量的紅細(xì)胞滲出、大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，且隨時(shí)間的推移，胰腺的炎癥程度加重（見(jiàn)圖2～4）。CHQY 組各時(shí)點(diǎn)大鼠胰腺輕微水腫，部份胰腺腺泡壞死，結(jié)構(gòu)稍模糊，壞死周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較SAP 組輕，胰腺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少許紅細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖5～7）。

圖1 Sham組(HE染色×400)

圖2 SAP組6 h(HE染色×400)

圖3 SAP組12 h(HE染色×400)

圖4 SAP組24 h(HE染色×400)

圖5 CHQY組6 h(HE染色×400)

圖6 CHQY組12 h(HE染色×400)

圖7 CHQY組24 h(HE染色×400)

2.6 胰腺組織病理學(xué)評(píng)分

SAP 組各時(shí)點(diǎn)胰腺病理學(xué)評(píng)分顯著升高（P＜0.05），且隨時(shí)間的推移嚴(yán)重程度越重，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CHYQ組12 h、24 h與SAP組對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較，胰腺組織的病理學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.05），6 h 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），（見(jiàn)表4）。

表4 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理學(xué)評(píng)分(±s)

表4 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理學(xué)評(píng)分(±s)

注：a與sham組相比，P＜0.05；bSAP組相比，P＜0.05

2.7 肝、腎組織的病理學(xué)觀察

正常組大鼠肝組織可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，無(wú)空泡、出血、壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖8）。SAP 組可見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，大量空泡形成，可見(jiàn)壞死細(xì)胞、充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血竇擴(kuò)張，肝索排列紊亂（見(jiàn)圖9～11）。CHQY組大鼠肝組織空泡及壞死均減少，肝小葉結(jié)構(gòu)稍紊亂，滲出及浸潤(rùn)較SAP 組明顯減少（見(jiàn)圖12～14）。Sham組大鼠腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)清晰、腎間質(zhì)無(wú)水腫、腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)或少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)充血及壞死（見(jiàn)圖15）；與假手術(shù)組比較，SAP組大鼠腎小球萎縮，大量炎細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管管腔內(nèi)大量淤血，管型形成，腎小管管腔變窄（見(jiàn)圖16～18）；CHQY 組大鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞損傷減輕，腎小球萎縮、紅細(xì)胞及炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管管腔變窄、管型形成等病理?yè)p害較SAP組減輕（見(jiàn)圖19～21）。

圖8 Sham組(HE染色×100)

圖9 SAP組6 h(HE染色×100)

圖10 SAP組12 h(HE染色×100)

圖11 SAP組24 h(HE染色×100)

圖12 CHQY組6 h(HE染色×100)

圖14 CHQY組24 h(HE染色×100)

圖15 Sham組(HE染色×100)

圖16 SAP組6 h(HE染色×100)

圖17 SAP組12 h(HE染色×100)

圖18 SAP組24 h(HE染色×100)

圖19 CHQY組6 h(HE染色×100)

圖20 CHQY組12 h(HE染色×100)

圖21 CHQY組24 h(HE染色×100)

2.8 肝、腎組織的病理學(xué)評(píng)分

SAP 組各時(shí)點(diǎn)肝組織、腎組織病理學(xué)評(píng)分較Sham組明顯升高（P＜0.05）。CHYQ組6 h、12 h、24 h與SAP 組對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較，肝組織的病理學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。CHQY 組12 h、24 h 與SAP 組對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)比較，腎組織的病理學(xué)評(píng)分降低（P＜0.05）（見(jiàn)表5）。

表5 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝腎組織的病理學(xué)評(píng)分(±s)

表5 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝腎組織的病理學(xué)評(píng)分(±s)

注：a與Sham組比較，P＜0.05；b與SAP組比較，P＜0.05

3 討論

SAP 極容易合并多器官功能損害，其中肝腎損害，尤其是肝衰竭、腎衰竭是其中最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的胰外器官損害,是導(dǎo)致SAP 患者死亡的最主要原因之一。研究表明，SAP 的嚴(yán)重程度與肝損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，肝損傷不僅能加重SAP的炎癥反應(yīng)，并且對(duì)其余器官，如腎和肺的損傷起著促進(jìn)作用[4]。關(guān)于SAP能并發(fā)嚴(yán)重的肝損傷主要是基于以下3個(gè)原因:首先胰腺與肝臟相鄰，胰腺的大量炎性滲出液波及肝臟導(dǎo)致肝損傷；其次肝臟是全身血流最豐富的器官，SAP 病程中產(chǎn)生的大量炎性細(xì)胞因子及內(nèi)毒素等通過(guò)靜脈血流入肝臟，加重肝臟的損傷；最后肝臟是全身最大的代謝及解毒器官，肝實(shí)質(zhì)的損害導(dǎo)致肝臟對(duì)炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的解毒和清除作用明顯下降，進(jìn)一步加重病情[5]。SAP并發(fā)腎損害的機(jī)制尚未完全明確，過(guò)去認(rèn)為與SAP 發(fā)病過(guò)程中有效循環(huán)血容量不足及微循環(huán)障礙，腎臟灌注不足所引起的缺血性損傷有關(guān)，近年來(lái)研究表明，SAP并發(fā)腎損害主要是由于SAP 致大量促炎因子釋放進(jìn)入血液，引起強(qiáng)烈的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）所致[6]，若發(fā)展至急性腎衰竭（ARF）后預(yù)后更差。因此，有效地預(yù)防或減輕肝腎功能的損傷對(duì)改善重癥急性胰腺炎患者預(yù)后和提高生存率具有重要意義。

SAP 組各時(shí)點(diǎn)大鼠剖腹后腹水明顯增多，胰腺腫脹、充血，腹腔臟器粘連明顯，網(wǎng)膜見(jiàn)大量皂化斑，血清AMS顯著升高，胰腺病理學(xué)評(píng)分升高，提示SAP模型成功建立。SAP 組ALT、AST、BUN、Scr 較Sham組顯著升高，肝組織及腎組織病理學(xué)評(píng)分升高，提示該SAP模型并發(fā)肝腎損害。CHQY組大鼠剖腹后腹腔腹水、網(wǎng)膜上的皂化斑較SAP 組減輕，血清AMS及胰腺病理組織學(xué)評(píng)分均低于SAP 組，提示柴黃清胰活血顆粒能改善胰腺組織的病理學(xué)評(píng)分，對(duì)SAP模型大鼠具有治療作用。AST、ALT、BUN、Scr 是分別反應(yīng)肝腎功能損害程度的重要指標(biāo)，CHQY 組大鼠血清的AST、ALT、BUN、Scr值均降低，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)CHQY組肝小葉壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂等均較SAP 組減輕；CHQY 組的腎組織腎小球萎縮程度、紅細(xì)胞及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p害均較SAP組減輕?？梢?jiàn)柴黃清胰活血顆粒能改善SAP模型大鼠的肝腎損傷，對(duì)多器官功能具有保護(hù)作用。

SAP 屬于中醫(yī)“胃脘痛”、“腹痛”、“脅痛”等范疇，中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)疾病部分國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)稱之為“胰癉”。SAP 早期主要臨床表現(xiàn)為：腹痛、惡心、嘔吐、腹脹、肛門停止排便排氣及腹膜炎等，這與《傷寒論》描述的陽(yáng)明腑實(shí)證—痞、滿、燥、實(shí)、堅(jiān)等證候相吻合。經(jīng)過(guò)多年臨床實(shí)踐總結(jié)，目前多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為其病機(jī)為濕熱壅滯、腑氣不通、毒瘀互結(jié)。其中濕熱壅滯是重癥急性胰腺炎最主要的病理機(jī)制。針對(duì)急性胰腺炎的主要病機(jī)，我院脾胃病專家、四川省名中醫(yī)周德端教授提出了“通腑瀉熱解毒、除濕散瘀止痛”的治療原則，在此法的指導(dǎo)下形成了中藥綜合治療方案：用胰癉1 號(hào)、胰癉2 號(hào)管胃（口服）、灌腸，配合西醫(yī)基礎(chǔ)治療，臨床療效確切，能縮短病程、減少并發(fā)癥，降低病死率，值得進(jìn)一步研究和推廣[7]。為了更好的總結(jié)周德端教授治療SAP的學(xué)術(shù)思想和用藥規(guī)律，提供更安全可靠、簡(jiǎn)便有效的治療藥物，現(xiàn)已將該方制成顆粒制劑—“柴黃清胰活血顆粒”。方中以生大黃為君藥以泄熱通腑；柴胡為臣藥以疏肝行氣；黃芩、梔子、蒲公英清熱解毒；枳實(shí)、厚樸助柴胡、大黃下氣消脹；延胡索理氣活血；丹參、桃仁、赤芍活血祛瘀；白芍緩急止痛，黃芪益氣托毒，甘草為使藥調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏瀉熱通腑、清熱解毒、行氣止痛、活血化瘀之功。現(xiàn)代藥理研究表明，方中所含藥物大多具有抗炎、抗菌的作用，對(duì)SAP有確切的治療作用。大黃游離蒽醌類物質(zhì)是大黃的主要活性成分，有研究表明大黃游離蒽醌能抑制全身炎癥反應(yīng)，減輕肝臟損傷,對(duì)重癥急性胰腺炎所致的肝損傷有保護(hù)作用[8]。厚樸的主要作用成分為厚樸酚、和厚樸酚，陳銀芳等人發(fā)現(xiàn)大黃素、蘆薈大黃素、厚樸酚、和厚樸酚的組方對(duì)AP大鼠有明顯治療作用,因其能夠調(diào)節(jié)NF-κB 蛋白的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)[9]。另有研究表明黃芩具有抗炎、抗菌、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用[10]。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷也具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎的作用，還可以通過(guò)對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控,達(dá)到抗肝損傷的作用[11]。

4 結(jié)論

柴黃清胰活血顆粒不僅對(duì)SAP 具有治療作用，對(duì)SAP 并發(fā)的肝腎損傷亦具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。