VEGF基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞后上清液對皮膚成纖維細(xì)胞及臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響*

李江璇，肖麗玲，李升紅，劉宏偉，潘瀟寒，張碧雅

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科， 廣東 廣州 510632)

脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是一類具有多向分化潛能的細(xì)胞，被證實可分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞等[1]，將其直接注射于損傷部位周圍可修復(fù)疾病所致受損細(xì)胞，如將脂肪干細(xì)胞輸入門脈系統(tǒng)治療肝臟疾病[2]。然而將人ADSCs(human ADSCs, HADSCs)直接應(yīng)用于人體可能存在一些風(fēng)險，包括其分化方向和生長調(diào)控的不確定性等，因此HADSCs上清液(HADSCs-conditioned medium， HADSCs-CM)的修復(fù)作用被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)已知ADSCs可分泌包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[3]、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)[4]、轉(zhuǎn)化生長因子和血管生成素[5]等生長因子，曾有實驗表明其上清液可促進成纖維細(xì)胞[6]和內(nèi)皮細(xì)胞[5]等的生長進而促進創(chuàng)面愈合，因此，我們試圖通過提高HADSCs的分泌功能并用其上清液培養(yǎng)細(xì)胞，觀察其對創(chuàng)面相關(guān)細(xì)胞的影響。

本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染VEGF165基因于HADSCs，并收集HADSCs-CM，觀察其對人皮膚成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblasts，HDFs)及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖及遷移的作用，為其在創(chuàng)面愈合方面提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM培養(yǎng)液和PBS溶液(HyClone)；ECM培養(yǎng)液(ScienCell)；人CD29-PE、CD90-PE、CD45-FITC和CD106-FITC 單克隆抗體(BD)；Ⅰ型膠原酶(Sigma)；人脂肪干細(xì)胞成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)液(Cyagen)；青霉素-鏈霉素液(灝洋公司)；胰蛋白酶和中性蛋白酶(Gibco)；免疫組化試劑盒(中杉金橋公司)；VEGF ELISA試劑盒(聯(lián)科生物公司)；bFGF ELISA試劑盒(Bio Swamp)；靶向VEGF165慢病毒(吉凱公司)。

CO2培養(yǎng)箱和細(xì)胞超凈工作臺(Esco)；倒置顯微鏡(Olympus)；低速離心機(中佳公司)；培養(yǎng)板(康寧公司)；CCK-8試劑盒(和元公司)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek)。

2 主要方法

2.1HADSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 將人皮下脂肪組織(來源于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科抽脂后棄用脂肪，患者年齡為20～45歲，符合倫理學(xué)會要求，本人知情同意)移入離心管中，使用含雙抗的PBS緩沖液洗滌，留下干凈上層脂肪，加入等體積0.1%的Ⅰ型膠原酶消化約1 h，待脂肪呈乳糜狀，300×g離心5 min棄上清， PBS重懸底層細(xì)胞并中和膠原酶，細(xì)胞篩過濾懸液至新離心管中；繼續(xù)300×g離心5 min棄上清，并加入含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸接種，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3 d后換液，細(xì)胞長滿至80%時消化傳代。鑒定：取第3代HADSCs，將細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，0.25%胰酶常規(guī)消化，制成1×106個每份的細(xì)胞懸液，分別于對應(yīng)的細(xì)胞中加入1～5 μL人CD29、CD90、CD44、CD45、CD105和CD106單克隆抗體，同時設(shè)立空白同型對照，室溫下避光孵育30 min，300×g離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2遍，后用200 μL PBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物(實驗重復(fù)3次)。使用第3代HADSCs，消化后以1×105的密度種于6孔板中，設(shè)立空白對照組及各誘導(dǎo)組(成脂、成骨和成軟骨)，對照組為正常培養(yǎng)液，誘導(dǎo)組為不同成分誘導(dǎo)液，約14 d后行對應(yīng)染料染色，觀察細(xì)胞誘導(dǎo)情況并拍照。細(xì)胞鑒定完成后進行后續(xù)實驗。

2.2HDFs的培養(yǎng)和鑒定 將人體包皮組織(來源于暨南大學(xué)泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)后棄用組織，患者年齡<25歲，符合倫理學(xué)會要求，本人知情同意)用含10%雙抗PBS緩沖液浸泡沖洗，用眼科剪去除皮下組織并剪成小條，加入1 mL中性蛋白酶消化過夜。第2天真皮和表皮分離，棄表皮，所剩真皮置于培養(yǎng)皿中，剪成糊狀；加1 mL胰蛋白酶浸沒真皮組織，300×g離心5 min棄上清，用含10%FBS、1%的雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸接種，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3天后更換培養(yǎng)液，細(xì)胞長滿至80%時傳代。取第3代細(xì)胞進行免疫組化染色鑒定及后續(xù)實驗。

2.3HUVECs的培養(yǎng)和鑒定 HUVECs購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)，以含10%FBS、1%雙抗和1%內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑的內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)液(ECM)培養(yǎng)細(xì)胞，隔2 d換液1次，細(xì)胞長滿至80%時消化傳代。為保證細(xì)胞未受到其他細(xì)胞污染，行相關(guān)鑒定，通過血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)免疫熒光染色鑒定該細(xì)胞。

2.4慢病毒轉(zhuǎn)染HADSCs并收集上清 將第4代的HADSCs以每孔5×104個接種于6孔板中，設(shè)立空白組及感染復(fù)數(shù)(multiply of infection, MOI)=10、20和30共4組。病毒為針對人類VEGF基因mRNA序列構(gòu)建重組的慢病毒VEGF165,轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后擴增病毒，并由綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記，病毒滴度為2×1011TU/L。將6孔板置入超凈臺，移去舊培養(yǎng)液，每孔換1 mL新鮮培養(yǎng)液，根據(jù)公式：所需病毒量=MOI×細(xì)胞量/病毒滴度，算出每孔需要病毒量，在每孔中加入病毒，輕輕“8”字混勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱感染4 h。加入病毒4 h后，每孔加1 mL培養(yǎng)液至足量。24 h后棄去含病毒培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后熒光顯微鏡下觀察GFP熒光強度，以后每隔2天各組換無血清培養(yǎng)液，并在每次換液時收集上清直至第10天，換液前在顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率并拍照。

2.5檢測上清中VEGF及bFGF的表達(dá) 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染第4、6、8和10天時，使用1 mL吸頭分別吸取轉(zhuǎn)染后脂肪干細(xì)胞上清(VEGF-CM)及正常上清(normal CM, Nor-CM)到離心管中，300×g離心5 min，將上清用0.22 μm的過濾器過濾到離心管中，儲存于-80 ℃冰箱中。測定時將細(xì)胞上清液從-80 ℃冰箱中取出融化；取出試劑盒，室溫平衡30 min，按照VEGF及bFGF的ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀檢測吸光度(A)值并分析。實驗重復(fù)3次。

2.6VEGF-CM對HDFs和HUVECs活力的影響 實驗前1 d，將HDFs和HUVECs用完全培養(yǎng)液以每孔2 000個接種到96孔板中，分為5組，每組5個復(fù)孔。因收集上清液中完全不含血清，故將完全培養(yǎng)液與VEGF-CM以1∶0、 1∶2、 1∶1、 2∶1和0∶1的比例配成5組，VEGF-CM選擇最佳濃度時的上清液。待細(xì)胞貼壁，約12 h后棄去舊培養(yǎng)液更換上述5種比例培養(yǎng)液，48 h后準(zhǔn)備用CCK-8試劑盒檢驗細(xì)胞活力。實驗重復(fù)3次。

2.7VEGF-CM對HDFs和HUVECs遷移的影響 將HDFs和HUVECs用完全培養(yǎng)液以每孔5×105個接種到6孔板中，6孔板背面提早劃橫線。分為：(1)完全培養(yǎng)液、(2)完全培養(yǎng)液與VEGF-CM按最佳比例混合及(3)完全培養(yǎng)液與normal-CM按最佳比例混合3組。6孔板中加入2種實驗細(xì)胞，待細(xì)胞80%滿時用無血清培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞12 h，饑餓后的細(xì)胞用200 μL吸頭劃痕，劃痕與橫線垂直，選取固定4個點為基準(zhǔn)。劃痕后用PBS洗2遍。換3種培養(yǎng)液，各組細(xì)胞在倒置顯微鏡下分別于0 h、 12 h和24 h拍照。由軟件Image-Pro Plus 6.0測量細(xì)胞遷移的距離。實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞的生物學(xué)特性

人脂肪干細(xì)胞：HADSCs培養(yǎng)3 d后可見細(xì)胞貼壁，7 d后快速增殖，呈“紡錘樣”長梭形，對第3代HADSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物進行流式檢測顯示：CD90、CD29、CD44和CD105呈陽性表達(dá)，CD45和CD106呈陰性表達(dá)，符合脂肪干細(xì)胞特性。經(jīng)成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)分化后，可被油紅O、茜素紅和阿爾辛藍(lán)染色，見圖1。

Figure 1.Multidirectional induced differentiation and identification of surface markers of HADSCs. A: osteogenic differentiation of HADSCs and alizarin red staining; B: adipogenic differentiation and oil red O staining; C: chondrocytes differentiation and Alcian blue staining; D: the surface marker identification of HADSCs.

圖1HADSCs多向誘導(dǎo)分化及表面標(biāo)志物鑒定

人成纖維細(xì)胞：原代HDFs生長10 d后爬滿瓶底，呈魚群樣或漩渦狀，傳代后細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞間無接觸抑制，可層層疊加。對細(xì)胞進行波形蛋白(vimentin)和Ⅰ型膠原免疫組化染色，結(jié)果呈陽性，見圖2。

Figure 2.The immunohistochemical staining of HDFs. A: vimentin staining; B: type Ⅰ collagen staining.

圖2HDFs免疫組化染色鑒定

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：HUVECs生長迅速，經(jīng)過1～2 d的潛伏期后進入對數(shù)生長期，約4天即可爬滿瓶底，呈鋪路石狀或短梭形; vWF表達(dá)呈陽性，見圖3。

Figure 3.The morphological change (A) and vWF immunofluorescence staining (B) of HUVECs.

圖3HUVECs的細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光染色鑒定

2 VEGF165慢病毒轉(zhuǎn)染后HADSCs及細(xì)胞因子表達(dá)

VEGF165慢病毒感染HADSCs后第2天，熒光顯微鏡下即可見部分細(xì)胞內(nèi)有微弱綠色熒光表達(dá)；隨著感染時間增加，熒光明顯增亮；至第7天細(xì)胞爬滿培養(yǎng)瓶時綠色熒光最強，而后隨著細(xì)胞生長、老化，細(xì)胞熒光表達(dá)主要集中于細(xì)胞核內(nèi)，如圖4所示。未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞未見熒光。

經(jīng)ELISA檢測，可見各組上清中VEGF與bFGF均呈陽性表達(dá)，而VEGF-CM中VEGF及bFGF的分泌水平明顯高于非轉(zhuǎn)染組。在轉(zhuǎn)染病毒后收集上清的第4天，VEGF的分泌開始增加，高峰在第8天，隨后逐漸下降，在MOI=30時分泌量最高。而bFGF的分泌自轉(zhuǎn)染后便保持相對較高，在第4天時未見到因病毒的毒性作用而分泌下降，高峰在第6天，見圖5。選擇MOI=30的轉(zhuǎn)染后上清液進行后續(xù)實驗。

3 VEGF-CM對HDFs及HUVECs活力的影響

CCK-8結(jié)果表明，1∶2組2種細(xì)胞的活力均顯著提高(P<0.05)，而無VEGF-CM組(1∶0組)細(xì)胞的活力較其它組低。這種促進增殖作用在HUVECs中明顯，并與VEGF-CM所占比例呈依賴關(guān)系，在0∶1組中即使只有VEGF-CM，仍有明顯的促增殖能力，1∶2組與0∶1組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，見圖6。

4 VEGF-CM對HDFs及HUVECs遷移的影響

將2種細(xì)胞不同時點的照片經(jīng)過Image-Pro Plus 6.0計算出劃痕后空白處的面積，由圖7、8可見，VEGF-CM組中2種細(xì)胞遷移距離明顯大于完全培養(yǎng)液組及Nor-CM組(P<0.05)，且在HDFs中促遷移能力顯著。

Figure 4.The fluorescence intensity after lentiviral transfection into HADSCs (MOI=30). A: 3 d; B: 5 d; C: 7 d; D: 9 d.

圖4攜帶VEGF165慢病毒轉(zhuǎn)染(MOI=30)HADSCs后的熒光強度

Figure 5.The growth factor content in the supernatants of the HADSCs in transfection groups with different MOI values and non-transfection group. Mean±SD.n=3.

圖5未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染組HADSCs上清液中生長因子的含量

Figure 6.The viability of HDFs and HUVECs treated with the mixed medium. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs1∶0 group.

圖6完全培養(yǎng)液與VEGF-CM不同比例混合后對HDFs和HUVECs活力的影響

Figure 7.The migration of HDFs treated with different culture media after scratch (×40). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol and Nor-CM group.

圖7完全培養(yǎng)液、正常上清和VEGF上清對HDFs遷移的影響

Figure 8.The migration of HUVECs treated with different culture media after scratch (×40). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol and Nor-CM group.

圖8完全培養(yǎng)液、正常上清和VEGF上清對HUVECs遷移的影響

討 論

自體ADSCs移植現(xiàn)可通過其多向分化和旁分泌等方式達(dá)到疤痕治療、皮膚年輕化和促進創(chuàng)面愈合等目的[7]，但臨床自體ADSCs的應(yīng)用受制于自身脂肪提取，如患者消瘦和營養(yǎng)不良等可導(dǎo)致ADSCs數(shù)量不足，此外，老齡化且有冠心病的患者其ADSCs被證明具有衰老特征，促血管生成因子的分泌量減少[8]，這些都會限制ADSCs自體細(xì)胞治療的有效性。因此利用干細(xì)胞上清液作用于創(chuàng)面治療是一種選擇，很多學(xué)者證明，ADSCs的上清液中含有豐富的生長因子，并可促進多種細(xì)胞的活力和遷移[6, 9]。在本實驗中，通過ELISA法證明在正常上清液中確實可檢測到一定量的生長因子，且表達(dá)水平較為穩(wěn)定，但我們試圖提高ADSCs的分泌能力再行進一步實驗。目前，提高VEGF分泌量的方法至少有以下2種[10]：(1)利用缺氧環(huán)境培養(yǎng)ADSCs，可促進其分泌VEGF和bFGF而加速創(chuàng)面愈合[4]；(2)利用基因?qū)爰夹g(shù)將目的VEGF基因整合入ADSCs[11]。慢病毒具有可容納大片段外源性基因、低免疫原性及長期穩(wěn)定表達(dá)等顯著優(yōu)點[12]，我們選擇慢病毒攜帶目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染ADSCs，本研究證明ADSCs可被慢病毒成功轉(zhuǎn)染VEGF基因，并可增強相關(guān)蛋白表達(dá)。

VEGF 最初于1983年發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時被稱作血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，后來研究者指出其與1989年牛垂體中檢測到的可特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)為同一物質(zhì)[13]。VEGF能特異性地促進內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的生長、增殖和遷移，以促血管生成為最大特點。bFGF是一個作用很強的有絲分裂原和血管生成因子，能吸引并刺激成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞等的增殖，與VEGF有協(xié)同作用[14]。有動物實驗表明，在Ⅲ度壓瘡中，組織缺血缺氧程度超過了機體的代償范圍，使得VEGF和bFGF的分泌下降，并呈正相關(guān)，從而導(dǎo)致壓瘡的繼續(xù)發(fā)展及難以愈合[15]。本實驗中也觀察到，轉(zhuǎn)染VEGF基因于ADSCs，轉(zhuǎn)染組上清液中VEGF及bFGF均得到提高，反映出二者的協(xié)同作用。本實驗通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)提高了ADSCs對VEGF和bFGF的表達(dá)，若將上清液作用于慢性創(chuàng)面，可對創(chuàng)面愈合起到積極作用。

本實驗證明，對比完全培養(yǎng)液和正常上清液，HUVECs的活力和遷移對VEGF-CM的依賴性十分明顯，這與VEGF-CM含有豐富的VEGF、bFGF等因子有關(guān)，其中還包括未行檢測的其它因子，如胎盤生長因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子和胰島素樣生長因子[5]等，各種因子相互協(xié)同作用，最終起到促進作用。同樣，比起其余2組，VEGF-CM對HDFs也有促進作用，而且促遷移能力更為顯著。

綜上所述，通過慢病毒轉(zhuǎn)染使ADSCs高表達(dá)VEGF，獲得含有豐富生長因子的VEGF-CM，其可促進HDFs及HUVECs的增殖及遷移。這為進一步研究脂肪干細(xì)胞上清液的臨床應(yīng)用提供方向，雖然作用機制仍需進一步的研究，但將外源性、高濃度的VEGF-CM應(yīng)用于局部創(chuàng)面十分簡單、方便，考慮為一種有效的治療方式。