Galectin-9調(diào)控SHH信號通路影響結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞凋亡*

趙 鑫，唐亞萍，陳琳琳，王淳閱，葉 峰△

(1廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科， 福建 廈門 361000； 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 2消化內(nèi)科， 3肝膽外科， 湖南 長沙 410008)

結(jié)直腸癌是一個全球范圍內(nèi)的健康問題，其發(fā)病率和死亡率較高，隨著結(jié)直腸癌早期診斷和治療方法的不斷進步，結(jié)直腸癌患者的生存率得到顯著提高，但是由于結(jié)直腸癌發(fā)展速度快、惡性程度極高，其仍然嚴(yán)重威脅人類健康，探討結(jié)直腸癌發(fā)病機制對于結(jié)直腸癌的治療具有重要意義[1]。Sonic Hedgehog(SHH)信號通路是一種與腫瘤發(fā)生有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其在腫瘤組織中過度激活，抑制其激活后可以降低腫瘤細(xì)胞的生長速度，并誘導(dǎo)其凋亡[2]。半乳糖凝集素9(galectin-9)在人類的脾臟、外周血淋巴細(xì)胞和胸腺等免疫組織及胃和肝臟等內(nèi)胚層起源組織中廣泛表達。多項研究表明，galectin-9在正常組織中的表達水平高于腫瘤組織，如結(jié)直腸癌和乳腺癌等。在卵巢癌中的研究顯示，galectin-9高表達可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其在卵巢癌中發(fā)揮抑制作用[3-5]。Galectin-9在結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡中的作用目前尚不明確。本實驗用結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞作為體外研究對象，初步探討galectin-9對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及機制，為明確結(jié)直腸癌的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29購自上海素爾生物科技有限公司；pcDNA3.1-Galectin-9由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；PCR和cDNA合成試劑均購自Thermo Fisher；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；抗galectin-9抗體購自BioVision；抗cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH抗體購自ABGENT；SHH信號通路特異性抑制劑cyclopamine購自上海瀚香生物科技有限公司。

2 方法

2.1細(xì)胞分組 HT29細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前的1 d接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞融合度為90%時進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用滅菌的PBS將細(xì)胞洗滌2次，換成不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，用Lipofectamine 2000進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將galectin-9過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Galectin-9和對照質(zhì)粒pcDNA3.1用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞用600 mg/L的G418篩選陽性克隆，篩選4周后，挑選陽性克隆擴大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Galectin-9和pcDNA3.1后的HT29細(xì)胞分別記為pcDNA3.1-Galectin-9組和pcDNA3.1組，另將沒有轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒DNA的細(xì)胞作為空白對照(control)組。用real-time PCR和Western blot測定過表達的效果。

2.2Real-time PCR實驗 在control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-Galectin-9各組細(xì)胞密度為90%時，按照每106個細(xì)胞中加入1 mL的TRIzol裂解液，提取細(xì)胞中的總RNA，保存在-70 ℃。取2 μg的RNA與0.5 μg的Oligo dT混合置于70 ℃孵育5 min后放置于冰上靜置2 min,再添加5 μL的5×M-MLV buffer、1.25 μL的dNTP Mixture、25 U的RNase inhibitor(40 U/μL)和200 U的M-MLV(200 U/μL)，添加RNase-free dH2O至25 μL，置于42 ℃保溫約2 h，在95 ℃孵育15 min后，置于冰上冷卻，得到cDNA。Real-time PCR體系：25 μL的SYBR Green PCR Mix(含有4 mmol/L的Mg2+)、各1 μL的上下游引物(10 μmol/L)、0.3 μL的TaqDNA polymerase、2 μL的cDNA和20.7 μL的ddH2O。Real-time PCR程序為: 95 ℃ 120 s；95 ℃ 30 s、59 ℃ 25 s、72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參照。用2-ΔΔCt法計算分析各組細(xì)胞中g(shù)alectin-9水平。Galectin-9的上游引物序列為5’-CGCCCCTGGACAGATGTT-3’，下游引物序列為5’-GACAGGAGGATGGACTTGGA-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-AGAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物序列為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

2.3Western blot實驗 在control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-Galectin-9各組細(xì)胞密度為90%時，以胰蛋白酶消化后，添加蛋白裂解液，每106個細(xì)胞加入500 μL的裂解液，4 ℃、12 000×g離心10 min，用移液槍取上清分裝以后，保存在-20 ℃。按照常規(guī)BCA法對蛋白進行定量以后，進行電泳。常規(guī)方法配制12%分離膠以及5%濃縮膠，每個泳道中添加40 μg樣品，設(shè)置電壓為90 V，觀察蛋白進入到底部邊緣后，終止電泳。取出凝膠，進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜：電壓設(shè)置為90 V，將轉(zhuǎn)膜裝置放在冰上進行，轉(zhuǎn)膜2 h后，關(guān)閉電源，此時凝膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到NC膜上。把NC膜放在提前配制好的5%脫脂奶粉的平皿中封閉，室溫緩慢搖晃反應(yīng)60 min。用TBST把NC膜洗滌3次以后，將NC膜放在含有1∶200稀釋抗galectin-9抗體的溶液內(nèi)，置于4 ℃冰箱內(nèi)緩慢搖晃過夜反應(yīng)，再以TBST洗膜后，至于1 ∶4 000稀釋的 II 抗反應(yīng)液中，置于室溫條件結(jié)合2 h，同樣以TBST洗膜，用ECL顯色，曝光(X膠片)后，分析內(nèi)參照GAPDH和目的蛋白galectin-9的吸光度(A)值。

2.4MTT法檢測細(xì)胞活力 各組細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入4×104個細(xì)胞。放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h以后，添加MTT溶液20 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱反應(yīng)4 h，棄掉上清，添加二甲基亞砜溶液150 μL，結(jié)合反應(yīng)10 min后，置于酶標(biāo)儀檢測490 nm處的A值,計算各組細(xì)胞存活率。存活率(%)=實驗組A值÷對照組A值×100%。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 在control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-Galectin-9各組細(xì)胞培養(yǎng)密度為90%時添加PBS將細(xì)胞各洗滌3次以后，加入400 μL緩沖液，分別加入Annexin V-FITC和PI約5 μL,室溫中結(jié)合15 min，上流式細(xì)胞儀檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡情況。

2.6細(xì)胞中cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH蛋白水平的測定 Control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-Galectin-9各組細(xì)胞用Western blot方法測定細(xì)胞內(nèi)的cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH蛋白水平，步驟同上，cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH抗體稀釋倍數(shù)分別為：1∶100、1∶600、1∶600和1∶600。

2.7SHH信號通路抑制劑cyclopamine對結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響 取轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Galectin-9后的細(xì)胞，在實驗0 h時，添加SHH信號通路特異性抑制劑cyclopamine(終濃度為3.0 μmol/L)，記為pcDNA3.1-Galectin-9+cyclopamine組，培養(yǎng)2 d后，分別檢測細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞術(shù))及細(xì)胞中cleaved caspase-3、Smo、Gli1和SHH蛋白水平，步驟同上，結(jié)果以pcDNA3.1-Galectin-9細(xì)胞作為對照。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組數(shù)據(jù)用獨立樣本t檢驗，多組間差異使用方差分析并用Bonferroni校正的t檢驗進行兩兩比較。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 pcDNA3.1-Galectin-9上調(diào)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中g(shù)alectin-9的表達水平

結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Galectin-9后，細(xì)胞中g(shù)alectin-9的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，轉(zhuǎn)染對照載體pcDNA3.1對結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中g(shù)alectin-9的mRNA和蛋白水平?jīng)]有影響，見圖1。這說明成功構(gòu)建了上調(diào)galectin-9表達的結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞株。

Figure 1.The expression level of galectin-9 in the colorectal cancer HT29 cells after transfection. A: the mRNA expression of galectin-9 in the HT29 cells after transfection; B: the protein expression of galectin-9 in the HT29 cells after transfection determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1轉(zhuǎn)染后結(jié)直腸癌細(xì)胞中g(shù)alectin-9水平的變化

2 上調(diào)galectin-9誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和caspase-3活化

上調(diào)galectin-9表達的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率顯著提高，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平升高，caspase-3活化水平增多(P<0.05)，見圖2。這說明上調(diào)galectin-9表達可以明顯誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞活力，促進caspase-3活化。

Figure 2.The effect of up-regulation of galectin-9 expression on the viability, apoptosis and cleaved caspase-3 protein level in the colorectal cancer HT29 cells. A: the changes of viability in the HT29 cells after galectin-9 expression was up-regulated; B: flow cytometry was used to analyzed the effect of galectin-9 over-expression on the apoptosis of the HT29 cells; C: Western blot was used to determine the effect of galectin-9 up-regulation on the protein level of cleaved caspase-3 in the HT29 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2上調(diào)galectin-9表達對結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞活力、凋亡和cleavedcaspase-3蛋白水平的影響

3 上調(diào)galectin-9表達降低結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中SHH信號通路的激活水平

上調(diào)galectin-9的結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中SHH信號通路關(guān)鍵蛋白Smo、Gli1和SHH表達水平降低，SHH信號通路激活水平降低(P<0.05),見圖3。這說明上調(diào)galectin-9可以明顯抑制結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中SHH信號通路的激活。

Figure 3.The effect of galectin-9 up-regulation on the expression of Smo, Gli1 and SHH of SHH signaling pathway-related proteins in the colorectal cancer HT29 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3上調(diào)galectin-9表達對結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中SHH信號通路關(guān)鍵蛋白Smo、Gli1和SHH表達的影響

4 SHH信號通路特異性抑制劑cyclopamine抑制上調(diào)galectin-9表達的結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中SHH信號通路的激活

SHH信號通路特異性抑制劑cyclopamine處理上調(diào)galectin-9表達的結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞，細(xì)胞中SHH信號通路關(guān)鍵蛋白Smo、Gli1和SHH的表達水平降低，SHH信號通路激活水平進一步降低(P<0.05),見圖4。這說明cyclopamine可以明顯抑制上調(diào)galectin-9的結(jié)直腸癌細(xì)胞中SHH信號通路的激活。

Figure 4.The effect of cyclopamine on the expression of SHH signaling pathway-related proteins Smo, Gli1 and SHH in the colorectal cancer HT29 cells with up-regulation of galectin-9 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1-Galectin-9 group.

圖4Cyclopamine對上調(diào)galectin-9表達的結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中SHH信號通路關(guān)鍵蛋白Smo、Gli1和SHH表達的影響

5 SHH信號通路特異性抑制劑cyclopamine誘導(dǎo)上調(diào)galectin-9表達的結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞凋亡

SHH信號通路特異性抑制劑cyclopamine處理上調(diào)galectin-9表達的結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率和caspase-3活化水平升高(P<0.05),見圖5。這說明cyclopamine可以明顯促進上調(diào)galectin-9表達的結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞的凋亡。

討 論

Galectins蛋白家族對β-半乳糖苷具有較強的親和力，目前發(fā)現(xiàn)至少15個蛋白成員，其主要在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中存在，參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其蛋白家族成員在人體組織中廣泛存在，參與炎癥、血管生成、母嬰耐受等多種生理和病理過程[6-8]。Galectin-9最早在研究霍奇金淋巴瘤腫瘤抗原中發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的作用，后續(xù)在多種腫瘤和對應(yīng)的癌旁組織中發(fā)現(xiàn)其表達水平差異較大[9-10]。多數(shù)研究表明，galectin-9在腫瘤中的表達水平低于對應(yīng)的癌旁組織，在乳腺癌、腎癌和宮頸癌等腫瘤中的研究表明，galectin-9在腫瘤中表達下調(diào)，而在白血病等腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)galectin-9表達水平增加[11-13]。目前的研究顯示，galectin-9在結(jié)直腸癌中低表達，其表達水平與腫瘤的分化程度、腫瘤患者性別和年齡等無關(guān)，與腫瘤患者遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等有關(guān)[3, 14]。

Figure 5.The effect of cyclopamine on the apoptosis and protein level of cleaved caspase-3 in the colorectal cancer HT29 cells with galectin-9 up-regulation. A: flow cytometry was used to analyze the apoptosis of the HT29 cells with galectin-9 up-regulation before and after cyclopamine treatment; B: Western blot was used to determine the protein level of cleaved caspase-3 protein in the HT29 cells with galectin-9 up-regulation before and after cyclopamine treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1-Galectin-9 group.

圖5Cyclopamine對上調(diào)galectin-9表達的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和cleavedcaspase-3蛋白水平的影響

Galectin-9具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡作用，在胃癌和卵巢癌等腫瘤細(xì)胞中均已證實，galectin-9過表達后可以通過促進胃癌細(xì)胞中caspase-3的活化發(fā)揮促凋亡作用[5,15-17]。Caspase-3是目前研究公認(rèn)的細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，其位于caspase凋亡反應(yīng)的下游，不僅參與腫瘤細(xì)胞等病理細(xì)胞凋亡過程，還參與心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等生理細(xì)胞凋亡過程，caspase-3只有被激活后才可以發(fā)揮凋亡促進的作用[18-20]。本實驗表明，高表達galectin-9的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中caspase-3活化水平也升高，galectin-9可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，這與上述實驗報道結(jié)果均表明，galectin-9能夠促進腫瘤細(xì)胞凋亡，galectin-9可能在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮抑制作用。

SHH基因定位于7q36染色體上，是人類3種Hedgehog同源基因中最為重要、研究最為廣泛的一種，在人類的多種組織和器官中廣泛存在，其不僅參與正常組織器官的生理功能發(fā)揮過程，還參與腫瘤和心血管系統(tǒng)疾病等病理過程[21-23]。Smo是一種7次跨膜的單一肽鏈，是SHH信號通路的重要組成部分，其可以調(diào)控Gli1的活化，參與下游靶基因的調(diào)控作用，SHH信號通路在消化系統(tǒng)惡性腫瘤、泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤等腫瘤組織中異常激活，其參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，抑制SHH信號通路可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞的惡性表型，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[24-25]。SHH信號通路不僅可以直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡，還參與多種與腫瘤相關(guān)基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡過程，如BRD4、LKB1等[26-27]。本實驗表明，高表達galectin-9的結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中Smo、Gli1和SHH蛋白水平降低，并且用SHH信號通路抑制劑可以協(xié)同galectin-9共同誘導(dǎo)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞凋亡，即galectin-9通過下調(diào)SHH信號通路激活水平而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，galectin-9在結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞凋亡中發(fā)揮促進作用，其作用機制與SHH信號通路激活受阻有關(guān)。Galectin-9在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮抑癌蛋白的作用，對于其是具體通過何種方式靶向調(diào)控SHH信號通路尚未研究。本實驗沒有在多株結(jié)直腸癌細(xì)胞中進行驗證，在后續(xù)實驗中會對上述內(nèi)容進行探索。本實驗結(jié)果明確了galectin-9對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及機制，為闡明結(jié)直腸癌發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。