右美托咪定對(duì)體外循環(huán)大鼠腦損傷的影響*

陳燕樺，張炳東，何芳，周麗芳，韋祎，謝玉波

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

右美托咪定是一種α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，廣泛用于臨床麻醉和重癥監(jiān)護(hù)室的鎮(zhèn)靜[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可以減輕腦缺血再灌注損傷和體外循環(huán)相關(guān)的腦損傷，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究[3-4]。為此，本實(shí)驗(yàn)將右美托咪定用于大鼠體外循環(huán)中，觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡、腦組織含水量、血漿中IL-6和海馬組織cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)，探討右美托咪定在體外循環(huán)中的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠48只，體重250～350 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為3組：假手術(shù)組（S組）、體外循環(huán)組（CPB組）和右美托咪定組（Dex組），每組16只。S組大鼠僅行動(dòng)靜脈穿刺置管術(shù)，不進(jìn)行體外循環(huán)轉(zhuǎn)流，120 min后結(jié)束實(shí)驗(yàn)；CPB組行體外循環(huán)轉(zhuǎn)流120 min；Dex組在體外循環(huán)前泵注右美托咪定2.5μg/kg（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），15 min給完，接著在體外循環(huán)轉(zhuǎn)流過(guò)程中持續(xù)泵注右美托咪定2.5μg/（kg·h）直至體外循環(huán)轉(zhuǎn)流結(jié)束。

1.2 大鼠體外循環(huán)模型的復(fù)制

腹腔注射1%戊巴比妥鈉（北京普博斯生物科技有限公司）0.5 ml/100 g麻醉大鼠，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，經(jīng)口腔將16 G靜脈留置導(dǎo)管（美國(guó)Arrow公司）插入氣管，行機(jī)械通氣，潮氣量3 ml/100 g，頻率60次/min，吸呼比為1.0∶1.5，實(shí)驗(yàn)中保持動(dòng)脈血?dú)舛趸挤謮壕S持在35～45 mmHg。頸前區(qū)、左右腹股溝處刮毛、消毒后縱向切開(kāi)皮膚，右頸外靜脈置入20 G靜脈穿刺針（北京史密斯醫(yī)療器械有限公司）至右心房，依靠重力引流靜脈血至貯血器（20 ml注射器，山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司）；右股靜脈置入22 G靜脈穿刺針行股靜脈引流；左、右側(cè)股動(dòng)脈分別置入24 G靜脈穿刺針，右側(cè)股動(dòng)脈行股動(dòng)脈灌注，左側(cè)股動(dòng)脈用于監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)血壓和行血?dú)夥治?。體外循環(huán)采用右股靜脈、右頸外靜脈–右股動(dòng)脈轉(zhuǎn)流。體外循環(huán)預(yù)充液：13 ml同種新鮮肝素化大鼠血液、5 ml乳酸林格液、5 ml 4%羥乙基淀粉溶液（重慶大新藥業(yè)股份有限公司）。靜脈給予肝素鈉（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司）500 u/kg，待激活全血凝固時(shí)間（ACT）≥480 s后，使用Stockert Ⅲ型雙頭滾壓泵（德國(guó)Stockert Ⅲ公司）和小動(dòng)物膜肺（東莞科威公司）轉(zhuǎn)流120 min。術(shù)中血?dú)夥治霾捎胕-STAT1血?dú)夥治鰞x（美國(guó)ABBOTT公司），ACT監(jiān)測(cè)采用ACT儀（美國(guó)Medtroniz公司）。體外循環(huán)期間維持血?dú)夥治鰯?shù)值在正常范圍，紅細(xì)胞壓積約為25%，灌注流量維持在100～120 ml/（kg·min），平均動(dòng)脈壓維持在75～90 mmHg，鼻咽溫度約36℃。體外循環(huán)轉(zhuǎn)流120 min后實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 ELISA法

每組隨機(jī)選取8只大鼠在體外循環(huán)前（T0）、體外循環(huán)1 h（T1）、體外循環(huán)2 h（T2）時(shí)采集靜脈血用于測(cè)定血漿IL-6濃度。靜脈血標(biāo)本1 000 r/min離心15 min，采集血漿上清液-20℃保存，最后采用ELISA試劑盒檢測(cè)血漿IL-6濃度。

1.4 TUNEL檢測(cè)

每組隨機(jī)選取8只大鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)升主動(dòng)脈灌注生理鹽水約100 ml至右心耳流出液體為無(wú)色，再灌注4℃、4%多聚甲醛（北京百奧萊博科技有限公司）約250 ml，至頭頸部變僵硬。斷頭取腦，常規(guī)石蠟包埋后行連續(xù)冠狀面切片，厚度4μm。按照TUNEL試劑盒（美國(guó)Roche公司）說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，經(jīng)熒光染色（TUNEL、DAPI、Merge染色）后觀察細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)較亮的綠色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取CA1區(qū)3個(gè)不同高倍視野（200倍），以平均密度比表示凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，平均密度比=積分光密度/選定對(duì)象的面積，取3次平均值。

1.5 Western blotting檢測(cè)

將剩余每組8只大鼠取新鮮海馬組織，按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50μg蛋白加入上樣緩沖液，蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，牛奶封閉2h，TBST洗膜后分別加入兔單克隆抗體cleaved Caspase-3（1∶1 000，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）和兔抗ACTB多克隆抗體（1∶3 000，美國(guó)Bioworlde公司），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后加入紅外標(biāo)記的二抗（1∶10 000，美國(guó)Cell Signaling Technology公司），室溫下避光孵育2 h，曝光成像。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜，灰度值用Imaga J軟件測(cè)定，以目的蛋白和內(nèi)參β-actin蛋白灰度值比值表示cleaved Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 腦組織含水量的測(cè)定

將每組8只大鼠去掉海馬后的腦組織稱(chēng)濕重，置于55℃干燥箱內(nèi)烘干24 h至恒重，稱(chēng)干重。計(jì)算腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間血漿IL-6濃度比較

CPB組、Dex組與 S組 T0、T1、T2的血漿 IL-6濃度比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的血漿IL-6濃度有差異（F=134.07，P=0.000）；②3組血漿IL-6濃度有差異（F=29.918，P=0.000），CPB 組較 S組高（P＜0.05），Dex組較CPB組低（P＜0.05）；③3組血漿IL-6濃度變化趨勢(shì)有差異（F=21.638，P=0.000）。見(jiàn)表1和圖1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間血漿IL-6濃度比較（n =8，pg/ml，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間血漿IL-6濃度比較（n =8，pg/ml，±s）

注：1）與 S組比較，P ＜0.05；2）與 T0比較，P ＜0.05；3）與CPB組比較，P ＜0.05

組別 T0 T1 T2 S 組 9.42±0.62 10.93±1.59 11.13±1.41 CPB 組 9.95±1.18 17.76±2.771）2） 19.37±2.401）2）Dex 組 9.91±1.67 16. 57±1.191）2） 15.22±1.822）3）

圖1 各組大鼠血漿IL-6濃度的變化趨勢(shì) （n =8）

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞和腦組織含水量比較

免疫熒光染色后，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)較亮的綠色顆粒，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。大鼠海馬CA1區(qū)的TUNEL染色圖片中，S組和Dex組可見(jiàn)少量散在綠色顆粒，而CPB組可見(jiàn)較多綠色顆粒（見(jiàn)圖2）。CPB組、Dex組、S組大鼠CA1區(qū)的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.732，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，CPB組較S組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞多（P＜0.05）；Dex組較CPB 組少（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

CPB組、Dex組、S組腦組織含水量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.431，P=0.013）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，CPB組高于S組（P＜0.05）；Dex組低于CPB組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

各組大鼠海馬CA1區(qū)cleaved Caspase-3蛋白在17 kD左右出現(xiàn)特異性條帶（見(jiàn)圖3）。CPB組、Dex組、S組海馬組織cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.89±0.03）、（0.63±0.06）和（0.60±0.06），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=76.244，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，CPB組高于 S組（P＜0.05）；Dex組低于CPB組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞 （熒光染色×200）

表2 各組大鼠CA1區(qū)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞和腦組織含水量比較（n =8，±s）

表2 各組大鼠CA1區(qū)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞和腦組織含水量比較（n =8，±s）

注：1）與S組比較，P ＜0.05；2）與CPB組比較，P ＜0.05

組別 凋亡陽(yáng)性細(xì)胞（個(gè)/mm2） 腦組織含水量/%S組 2.23±0.74 77.07±1.55 CPB組 8.97±1.271） 79.65±1.621）Dex組 5.98±0.812） 77.49±1.862）F值 96.732 5.431 P值 0.000 0.013

圖3 各組大鼠海馬組織cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)

3 討論

體外循環(huán)是一種非生理狀態(tài)，血液與體外循環(huán)管道等接觸時(shí)可以產(chǎn)生大量炎癥因子，激活補(bǔ)體，引起全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致全身組織器官損害[5-6]。體外循環(huán)心臟外科手術(shù)后出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙和腦損傷等[7]，會(huì)延長(zhǎng)患者術(shù)后恢復(fù)時(shí)間，增加患者住院日，增加病死率和醫(yī)療費(fèi)用等，因此減輕體外循環(huán)相關(guān)的腦損傷非常迫切。

研究表明，右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與右美托咪定減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[8-9]。IL-6是一個(gè)重要的促炎因子，可以激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路[10]。Caspase-3是與凋亡相關(guān)的一種調(diào)解蛋白[11]，其激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增多，所以細(xì)胞凋亡增加時(shí)，可發(fā)現(xiàn)cleaved Caspase-3表達(dá)增多[12]。

本研究結(jié)果顯示，體外循環(huán)可以引起大鼠腦組織水腫加重和海馬神經(jīng)元凋亡增多，并且促進(jìn)IL-6和凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)；使用右美托咪定可以減輕體外循環(huán)導(dǎo)致的大鼠腦組織水腫和減少大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，下調(diào)炎癥因子IL-6和凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)，說(shuō)明右美托咪定對(duì)大鼠體外循環(huán)有腦保護(hù)作用。

綜上所述，體外循環(huán)可以誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡增多，而右美托咪定可以減輕大鼠體外循環(huán)相關(guān)的腦損傷，其機(jī)制可能與其減輕體外循環(huán)相關(guān)的炎癥反應(yīng)，下調(diào)cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。