CCR3缺乏通過減少tau蛋白激酶的活化以及tau過度磷酸化促進小鼠空間記憶缺陷的改善

隋軼 張堯 徐冰

【摘要】 目的 本研究擬探討趨化因子受體CCR3在阿爾茨海默病（AD）小鼠模型中對于tau蛋白病理的介導(dǎo)作用， 以及對于其認知功能障礙的影響。方法 采用野生型同窩（WT）、CCR3-/-、APP/PS1及APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠， 應(yīng)用蛋白印跡實驗檢測磷酸化tau蛋白以及磷酸化tau蛋白激酶水平;應(yīng)用Morris水迷宮檢測小鼠空間記憶缺陷。結(jié)果 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的CCR3缺陷減少了tau過度磷酸化和tau激酶的活化， 同時改善了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶缺陷（P<0.05， one-way ANOVA）。結(jié)論 CCR3缺乏可以通過減少tau蛋白激酶的活化以及tau過度磷酸化而促進APP/PS1小鼠的空間記憶缺陷的改善。CCR3可能成為治療AD的潛在藥物靶點。

【關(guān)鍵詞】 阿爾茨海默病;tau蛋白磷酸化;趨化因子;CCR3

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.05.111

AD患者腦內(nèi)的tau蛋白過度磷酸化， 神經(jīng)原纖維纏結(jié)， 以及神經(jīng)元和突觸的喪失與認知功能障礙密切相關(guān)[1]。針對tau蛋白病理， 而不是β淀粉樣蛋白的臨床治療方法可能會更有效。tau是一種高度可溶的， 天然未折疊的微管相關(guān)蛋白， 主要集中在軸突中并與微管結(jié)合， 從而穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。通過微管相關(guān)蛋白Tau（MAPT）基因的替代mRNA剪接在成年人腦中表達了6種tau同型異構(gòu)體， 所有這些都已在AD相關(guān)病變中檢測到。在涉及tau的所有疾病中， 過度磷酸化的tau不能與微管相互作用， 因此破壞了軸漿流動。AD的特征在于腦中存在高水平的過度磷酸化tau神經(jīng)元內(nèi)包涵體。實際上， tau過度磷酸化可能促進其自組裝成配對的螺旋絲和直絲， 并形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。在帶有可溶性tau聚集體的神經(jīng)元死亡之后， tau細絲可以存在于細胞外空間中;將這些可溶性低聚物轉(zhuǎn)化為不溶性絲狀tau沉積物是其病理的關(guān)鍵步驟， 其構(gòu)成了潛在的治療靶點。CCL11是可能參與AD病理學(xué)的一種重要趨化因子。CCL11在衰老過程中已被證明在血清中逐漸升高， 其年齡依賴性增加與海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)的缺陷相關(guān)。上述這些與老化相關(guān)的變化可以通過腦室內(nèi)注射重組CCL11進行重復(fù)， 并且可以通過全身或腦室內(nèi)給予CCL11的中和抗體來預(yù)防 [2]。因此， CCL11很可能是影響海馬功能的關(guān)鍵因素， 并與AD有密切關(guān)聯(lián)。CCL11與一種由星形膠質(zhì)細胞， 小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元表達的趨化因子受體， CCR3結(jié)合 [3]。本研究證明受體CCR3的缺乏通過減少CCL11導(dǎo)致的tau過度磷酸化和tau激酶的活化， 從而挽救了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶缺陷?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 CCR3-/-和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠[B6C3-Tg表達嵌合小鼠/人APP（Mo/HuAPP695swe）]和突變型人PS1（PS1-dE9）蛋白小鼠購自The Jackson Laboratory。將這些小鼠與C57BL/6種系回交至少8代。獲得CCR3基因缺陷小鼠（APP/PS1/CCR3-/-）， 將雜合的APP/PS1小鼠連續(xù)與CCR3-/-小鼠雜交， 隨后進行交叉。

1. 2 蛋白質(zhì)印跡分析 將細胞或腦組織在含有蛋白酶抑制劑混合物的TBS（20 mM Tris-HCl緩沖液， pH 7.4， 150 mM NaCl）中勻漿， 包括0.5 mM苯甲基磺酰氟， 20 μg/ml抑肽酶， 20 μg/ml 亮抑酶肽， 20 μg/ml 胃蛋白酶抑制劑和1 mM EDTA。將勻漿物短暫超聲處理并以15000×g離心30 min。在還原條件下， 將樣品（每泳道10 μg蛋白質(zhì)）在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用含有0.1% Tween 20， 3%干乳的TBS封閉膜1 h， 然后在室溫下用特異性抗體孵育2 h。洗滌后， 將印跡與相應(yīng)的HRP標(biāo)記的第二抗體（1∶1000稀釋）一起溫育1 h。使用ECL系統(tǒng)檢測標(biāo)記。使用光密度測定軟件分析條帶。

1. 3 Morris水迷宮測試 高齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生AD樣認知缺陷 [4]。在APP/PS1小鼠中， 驗證CCR3缺乏是否可以挽救AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶缺陷的假設(shè)。為此， 進行了Morris水迷宮測試， 用于比較APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠的學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)（12個月大）和它們的同窩小鼠。使用Morris水迷宮測試12個月大的WT、CCR3-/-、APP/PS1和APP/PS1/CCR3-/-小鼠。將小鼠以準隨機方式放入水中， 并允許其在120 s內(nèi)搜索平臺。一旦到達平臺， 允許小鼠在其上保持10 s。如果小鼠在120 s內(nèi)未能找到平臺， 則實驗者會協(xié)助它在同一時間內(nèi)站在平臺上。試驗后， 將小鼠取出， 干燥并置于單獨的籠中約60 min直至下一次試驗。對小鼠進行連續(xù)5 d， 4次/d試驗的訓(xùn)練， 并記錄它們的空間學(xué)習(xí)分數(shù)（以秒為單位， 找到平臺）。在最后一次訓(xùn)練（第5天）后24 h進行的空間探針試驗中， 移除平臺并使小鼠自由游泳90 s， 并記錄其在目標(biāo)象限中花費的時間。所有運動都由計算機化跟蹤系統(tǒng)記錄。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（ x-±s）表示， 采用單因素方差分析， 然后進行Fisher最不顯著差異事后分析， 以確定顯著的效果。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的CCR3缺陷降低tau過度磷酸化和tau激酶的活化 與WT小鼠相比， APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬組織中多個部位的tau蛋白過度磷酸化顯著增加， 均與包括ERK1/2、CDK5和GSK3β的tau激酶的顯著激活有關(guān)（P<0.05， one-way ANOVA）。同時， 與APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠相比， APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠表現(xiàn)出tau的過度磷酸化、tau激酶活性顯著降低（P<0.05， one-way ANOVA）。

2. 2 CCR3 缺陷挽救了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶缺陷 APP/PS1小鼠表現(xiàn)出使用可用的視覺空間線索來定位水下逃生平臺的學(xué)習(xí)能力受損;APP/PS1/CCR3-/-三重突變小鼠在該任務(wù)中表現(xiàn)出顯著改善的學(xué)習(xí)能力（P<0.05， one-way ANOVA）。

3 討論

趨化因子在衰老期間的血清中水平升高， 并且在AD腦中的神經(jīng)炎癥過程中由活化的神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生， 因此它在神經(jīng)變性疾病中的作用正在引起越來越多的關(guān)注。在本研究中， 證明了在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中， CCL11受體CCR3的缺乏顯著降低了tau蛋白過度磷酸化和tau蛋白激酶如ERK1/2、CDK5和GSK3β的活化， 這同時與小鼠的學(xué)習(xí)和記憶改善有關(guān)。因此， CCR3介導(dǎo)的趨化因子CCL11的神經(jīng)炎癥作用可能直接參與AD發(fā)病機制。

在AD患者的大腦中， tau異常過度磷酸化， 并且在這種改變的狀態(tài)下， 它聚集成成對的螺旋狀細絲， 形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。據(jù)推測， 不同部位的tau 蛋白過度磷酸化對其生物學(xué)功能及其致病作用有不同的影響。而在Ser262、Thr231和Ser23位點的 tau過度磷酸化抑制其與微管的結(jié)合， 在Ser199/Ser202/Thr205、Thr212、Thr231/Ser235、Ser262/Ser356和Ser422位點的超磷酸化使tau轉(zhuǎn)換成為一種抑制正常微管相關(guān)蛋白的抑制分子。趨化因子似乎是涉及tau病理學(xué)的重要因素。例如， CXCL1 通過CXCR2（CXCL1 受體）介導(dǎo)的ERK1/2激活觸發(fā)原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中的tau蛋白過度磷酸化?，F(xiàn)在， 本研究提供證據(jù)證明CCL11/CCR3在tau蛋白過度磷酸化中發(fā)揮作用。同時， CCR3缺乏逆轉(zhuǎn)了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦中CDK5和GSK3β磷酸化的增加。本研究確定了CCL11/CCR3 導(dǎo)致tau 過度磷酸化的途徑。

本研究的行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CCR3缺陷挽救了APP/PS1小鼠空間記憶缺陷。盡管在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的減弱的突觸損失和改善的空間學(xué)習(xí)能力可以歸因于減輕的Aβ產(chǎn)生和神經(jīng)炎癥， 這兩者在AD中均有助于突觸損失和認知缺陷的發(fā)生， 但是基于本研究中CCR3缺乏所致tau蛋白過度磷酸化和tau激酶活化減少的研究結(jié)果， 本研究提出CCL11/CCR3在APP/PS1小鼠空間記憶缺陷改善中起直接作用。

綜上所述， 本研究的發(fā)現(xiàn)支持這樣的假設(shè)：CCR3缺乏可以通過減少tau蛋白激酶的活化以及tau過度磷酸化而促進APP/PS1小鼠的空間記憶缺陷的改善。

參考文獻

[1] Mattson MP. Pathways Towards and Away from Alzheimers Disease. Nature， 2016， 430（7000）：631-639.

[2] Villeda SA， Luo J， Mosher KI， et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature， 477（7362）：90-94.

[3] He J， Chen Y， Farzan M， et al. CCR3 and CCR5 are co-receptors for HIV-1 infection of microglia. Nature （London）， 1997， 385（6617）：645-649.

[4] Ding Y， Qiao A， Wang Z， et al. Retinoic Acid Attenuates ？-Amyloid Deposition and Rescues Memory Deficits in an Alzheimer＼"s Disease Transgenic Mouse Model. Journal of Neuroscience， 2008， 28（45）：11622-11634.

[收稿日期：2018-11-12]