氧化應(yīng)激因素在干眼中的實(shí)驗(yàn)研究

林 啟，吳康瑞，邵 毅

0引言

干眼是指任何原因造成的淚液質(zhì)或量異?；騽?dòng)力學(xué)異常，導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有眼部不適和(或)眼表組織病變特征的多種疾病的總稱(chēng)。主要的病理生理機(jī)制為淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透性升高、眼表炎癥與損傷及神經(jīng)感覺(jué)異常[1]。以往臨床和實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，干眼是一種多因素慢性炎癥性疾病，由外在或內(nèi)在因素導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定和高滲。在某些情況下淚液成分的這些變化會(huì)與全身因素相結(jié)合，導(dǎo)致炎癥循環(huán)，引起眼表上皮異常和神經(jīng)刺激[2]。衰老是干眼重要的危險(xiǎn)因素之一[3]，流行病學(xué)調(diào)查研究表明，干眼的患病率隨年齡增長(zhǎng)而增加[4]，而氧化應(yīng)激是年齡相關(guān)性干眼的重要危險(xiǎn)因素之一[5]，同時(shí)又與炎癥途徑的激活有關(guān)[6]。有研究支持銅鋅超氧化物歧化酶家族(Cu、Zn SOD家族)是主要的抗氧化系統(tǒng)，而缺乏SOD-1的小鼠將加速衰老[7]。還有研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠角膜上皮化生和胞質(zhì)脂褐素樣物質(zhì)沉積增多，并伴隨抗氧化標(biāo)記物維生素E的含量下降[8]。而限制熱量的飲食可以防止許多器官因營(yíng)養(yǎng)不良而導(dǎo)致的功能衰退[9]。本文將對(duì)氧化應(yīng)激因素在干眼中的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行綜述。

1與氧化應(yīng)激有關(guān)的干眼的病理生理學(xué)機(jī)制

1.1活性氧與干眼氧化應(yīng)激因素對(duì)干眼的影響可用干眼周期來(lái)描述[10]。這個(gè)系統(tǒng)的核心因素是活性氧(reactive oxygen species，ROS)，當(dāng)ROS水平增加時(shí)，各種抗氧化酶水平上調(diào)，可能產(chǎn)生負(fù)反饋以調(diào)節(jié)應(yīng)激信號(hào)的強(qiáng)度或降低ROS水平。正常情況下抗氧化防御系統(tǒng)維持ROS于低水平，應(yīng)激信號(hào)強(qiáng)度正常。各種外界因素如紫外線、污染物、藥物和年齡等都可引起ROS水平升高。不可控制的ROS的升高可直接損傷淚液脂質(zhì)層等結(jié)構(gòu)以及眼表神經(jīng)的髓鞘，導(dǎo)致干眼的發(fā)生。因此，抗氧化防御對(duì)于保持活性氧水平低于誘導(dǎo)過(guò)度應(yīng)激信號(hào)閾值的水平至關(guān)重要。ROS是干眼良好的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，可以反映干眼的病程和治療效果。監(jiān)測(cè)過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)ROS水平隨年齡升高增加并伴隨氧化酶和抗氧化酶水平的降低。也可通過(guò)降低ROS水平而不必著重糾正干眼周期的其他問(wèn)題來(lái)治療干眼。

1.2高滲淚液和眼表炎癥與干眼淚液是眼表面上皮細(xì)胞的細(xì)胞外液，含水淚液流量減少或含水淚液蒸發(fā)增加將導(dǎo)致淚液高滲透壓，這是干眼進(jìn)入惡性循環(huán)的關(guān)鍵步驟。淚液高滲透壓引起形態(tài)學(xué)變化，例如結(jié)膜和角膜細(xì)胞的凋亡，并引發(fā)導(dǎo)致進(jìn)一步細(xì)胞死亡的炎癥級(jí)聯(lián)，包括產(chǎn)生粘蛋白的杯狀細(xì)胞的喪失。慢性炎癥最終會(huì)降低特定的淚液成分，加劇了淚膜的不穩(wěn)定性，使干眼惡性循環(huán)并長(zhǎng)期存在[11]。

2氧化應(yīng)激與干眼相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)

2.1體外實(shí)驗(yàn)證明氧化應(yīng)激與干眼有關(guān)的證據(jù)主要基于體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在體外實(shí)驗(yàn)中，以高滲培養(yǎng)基的形式模擬人角膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的環(huán)境，進(jìn)行人角膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中可觀察到年齡相關(guān)的ROS生成增加并伴隨氧化酶和抗氧化酶水平的降低，線粒體DNA損傷以及膜脂質(zhì)過(guò)氧化中氧化標(biāo)記物顯示的膜損傷[12]。

2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 SOD1基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)一項(xiàng)Sod1(-/-)小鼠的研究指出了氧化應(yīng)激與干眼之間的關(guān)系。該研究顯示在Sod1(-/-)小鼠與野生型小鼠相比淚腺和瞼板腺(meibomian gland，MG)中存在組織病理學(xué)、功能性和炎性年齡依賴(lài)性變化。首先自由基生成和清除抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡導(dǎo)致了氧化應(yīng)激，這與許多年齡相關(guān)疾病中觀察到的細(xì)胞損傷情況一致。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)家族是一種主要的抗氧化系統(tǒng)，Cu、Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)在小鼠體內(nèi)的缺乏導(dǎo)致了許多類(lèi)似于加速老化的表型。在這項(xiàng)研究中，我們檢查了Sod1(-/-)小鼠淚腺的形態(tài)特征和分泌功能。淚腺的光鏡檢查顯示腺泡單位萎縮、纖維化， CD4(+)T細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；電子顯微鏡檢查結(jié)果揭示了上皮-間質(zhì)細(xì)胞化生，腫脹和退化線粒體，并且在衰老的Sod1(-/-)小鼠的淚腺中存在凋亡細(xì)胞[7]。另外還觀察到了瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction，MGD)[13]，MGD是加劇干眼的主要原因，造成腺體減少導(dǎo)致淚膜脂質(zhì)減少，淚液水分蒸發(fā)增加，淚膜滲透壓增加進(jìn)而形成眼表面的變化，如淚膜不穩(wěn)定和瞼緣炎[14]。

2.2.2轉(zhuǎn)基因小鼠模型實(shí)驗(yàn)氧化損傷和炎癥被認(rèn)為與外分泌腺的年齡相關(guān)功能衰退有關(guān)。然而，氧化應(yīng)激如何影響外分泌腺分泌功能的分子機(jī)制尚不清楚。在一種新型mev-1條件轉(zhuǎn)基因小鼠模型(Tet-mev-1)中，發(fā)現(xiàn)淚腺線粒體氧化損傷導(dǎo)致淚腺功能障礙，淚液生成減少，ROS生成增加，進(jìn)而導(dǎo)致干眼的發(fā)生。mev-1基因編碼Cyt-1是線粒體復(fù)合物Ⅱ中琥珀酸-泛醌氧化還原酶的細(xì)胞色素b 560大亞基，與人體中的琥珀酸脫氫酶C亞基(SDHC)同源。該mev-1基因誘導(dǎo)過(guò)度氧化應(yīng)激，與眼表上皮損傷、淚液蛋白和淚液分泌功能下降有關(guān)。Tet-mev-1小鼠淚液量低于野生型小鼠，組織病理學(xué)分析顯示淚腺炎癥主要表現(xiàn)為淚腺單個(gè)核白細(xì)胞浸潤(rùn)和淚腺纖維化。這些發(fā)現(xiàn)表明，氧化應(yīng)激可能是干眼發(fā)展的致病因素[15]。

2.2.3糖尿病干眼小鼠模型實(shí)驗(yàn)涉及糖尿病誘導(dǎo)干眼的小鼠研究也支持氧化應(yīng)激與干眼之間的聯(lián)系。SIRT1是一個(gè)與延長(zhǎng)壽命，DNA損傷，代謝應(yīng)激，炎癥和癌癥相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[16]，并且與ROS生成有關(guān)，是一種依賴(lài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的脫乙?；竅17]。而ROS的釋放和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生被認(rèn)為是糖尿病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素[18]，實(shí)驗(yàn)表明糖尿病的誘導(dǎo)產(chǎn)生與SIRT1和另一種抗氧化劑SOD的表達(dá)增加有關(guān)，這個(gè)過(guò)程會(huì)持續(xù)4wk，并在隨后8wk內(nèi)表達(dá)降低[19]。實(shí)驗(yàn)將干眼組中的每只小鼠每天3次注射氫溴酸東莨菪堿，并結(jié)合低濕度環(huán)境以建立干眼模型，結(jié)果顯示淚液生成明顯減少，角膜熒光素染色增加，且與抗氧化功能的時(shí)間變化有關(guān)。隨著疾病的進(jìn)展，所有實(shí)驗(yàn)組均顯示HE染色明顯的病理改變[19]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地說(shuō)明了干眼確實(shí)與氧化改變有關(guān)。

2.2.4限制大鼠飲食模型實(shí)驗(yàn)及其他實(shí)驗(yàn)淚腺分泌功能的降低與衰老密切相關(guān)，并導(dǎo)致干眼的患病率增加。由于熱量限制(calorie restriction, CR)被認(rèn)為可以防止由于衰老引起的各種器官的功能衰退，故限制大鼠熱量攝入可作為抗氧化應(yīng)激的一種干預(yù)。限制熱量飲食6mo后，在有意識(shí)狀態(tài)下大鼠檢查淚液功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠淚腺功能優(yōu)于非限熱量對(duì)照組。用卡巴膽堿進(jìn)行淚液蛋白分泌刺激實(shí)驗(yàn)，并用8-羥基-2 脫氧鳥(niǎo)苷(8-hydroxyl-2 deoxyguanosine, 8-OHdG)和4-羥基壬烯醛(hydroxynonenal, HNE)評(píng)估氧化應(yīng)激。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組淚液體積明顯改善并且在卡巴膽堿刺激后淚液蛋白分泌量增加，腺泡單位密度顯著提高，表現(xiàn)出較小程度的間質(zhì)纖維化，且淚腺中8-OHdG的濃度和HNE染色的程度降低[20]。這些結(jié)果證明了CR可以減輕淚腺中與氧化應(yīng)激相關(guān)的損傷。在另一種大鼠模型中,將大鼠連續(xù)暴露于低濕度氣流中30d，氧化應(yīng)激標(biāo)記物(8-OhdG，HNE)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，熒光素染色增加，這是干眼的臨床特征[21]。在衰老大鼠中，有證據(jù)表明淚腺分泌眼淚所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的改變會(huì)導(dǎo)致干眼：rab3d mRNA和rab27b mRNA的表達(dá)和rab3d蛋白的表達(dá)降低，而突觸融合蛋白水平增加[22]。

3干眼與氧化應(yīng)激的介入實(shí)驗(yàn)研究

3.1減少ROS的物質(zhì)研究表明，某些物質(zhì)能夠降低ROS水平。在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激下培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞中，用乳鐵蛋白和黃原膠培育可以保護(hù)細(xì)胞免受ROS的有害影響[23-24]，黃原膠還能降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平[24]。另外在活細(xì)胞中，某些抗氧化酶的水平可能在對(duì)ROS威脅的直接反應(yīng)中受到嚴(yán)格調(diào)控。在藍(lán)莓提取物中所發(fā)現(xiàn)的左旋肉堿和紫檀芪，均能降低氧化損傷生物標(biāo)志物和炎癥介質(zhì)的水平，同時(shí)降低抗氧化酶的水平[25-26]。

3.2減輕氧化應(yīng)激損傷的物質(zhì)對(duì)小鼠和大鼠疾病模型的臨床前干預(yù)研究表明氧化應(yīng)激造成的損傷可以被有效降低。在一項(xiàng)用抗氧化藥用植物提取物對(duì)干眼小鼠進(jìn)行的研究中，未經(jīng)過(guò)給藥的對(duì)照組小鼠淚腺組織中不僅存在氧化損傷，而且有眼表炎癥的證據(jù)：淚液白細(xì)胞介素(IL-1b、IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN-c)及其相關(guān)趨化因子、CD4 c-x-c趨化因子受體(Cr3t)細(xì)胞)均有升高。其臨床特點(diǎn)包括淚液產(chǎn)生及淚膜破裂時(shí)間(breakup time of tear, BUT)的減少，角膜熒光素染色增加，產(chǎn)生粘液的杯狀細(xì)胞密度降低。這些特征在實(shí)驗(yàn)組通過(guò)治療均得到了改善[27]。另外，干眼在絕經(jīng)后婦女中很普遍，因?yàn)楦昶谄陂g激素水平的變化會(huì)影響瞼板腺功能，導(dǎo)致蒸發(fā)性干眼和淚液不穩(wěn)定，高滲性和促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生。在絕經(jīng)后干眼大鼠模型中，治療組大鼠用α-硫辛酸(α-lipoic acid，ALP)給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淚道功能恢復(fù)，Schirmer試驗(yàn)改善。α-硫辛酸是一種內(nèi)源性合成的線粒體酶復(fù)合物的輔助因子，其生物學(xué)效應(yīng)包括ROS的吸收、促進(jìn)如維生素C和維生素E等其他抗氧化劑的相互作用和再生，以及氧化還原過(guò)程的調(diào)節(jié)。α-硫辛酸改變了活性氮物質(zhì)的代謝，導(dǎo)致淚腺過(guò)氧化物酶活性增加和淚液生成改善[28]。這些研究表明有許多物質(zhì)能夠減少氧化應(yīng)激的損害，改善干眼狀。

4總結(jié)與展望

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，氧化應(yīng)激因素與干眼具有密不可分的聯(lián)系。眼表氧化應(yīng)激的研究尚處于起步階段，極有可能將實(shí)驗(yàn)研究成果應(yīng)用于臨床。氧化應(yīng)激為干眼的治療提供了新依據(jù)，未來(lái)研究的潛在領(lǐng)域包括眼部抗氧化治療的途徑。今后幾年，對(duì)眼表面氧化應(yīng)激的研究可能會(huì)產(chǎn)生越來(lái)越大的影響。因此，眼科從業(yè)者應(yīng)該意識(shí)到氧化應(yīng)激在干眼中的作用。