鼻腔定植耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分離及其對消毒劑抗性研究

□李旺勝 于凡凡 肖 娜 唐一通

一、材料與方法

(一)菌株來源。試驗菌株為收集自108例健康在校大學生鼻拭紙樣本(男生65例，女生43例)，所有樣本均為來自不同個體的非重復性樣本。

(二)實驗材料。金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagarTM法國科瑪嘉)，哥倫比亞血瓊脂平板，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,Ezup柱式細菌基因組DNA抽取試劑盒，即用Taq PCR擴增試劑盒，擴增引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。試驗所用碘伏消毒劑(有效碘0.5%)和75%乙醇購自江西草珊瑚消毒用品有限公司。

(三)試驗方法。

1.菌株顯色培養(yǎng)與MRSA菌株鑒定。將收集鼻拭紙樣本接種至顯色培養(yǎng)基，37℃，恒溫培養(yǎng)48小時，挑取紅色或粉紅色菌落保存。并將挑選好的菌落接種至哥倫比亞血瓊脂平板，37℃，恒溫培養(yǎng)24小時。提取菌株基因組，進行SCCmecA基因PCR擴增，鑒定MRSA菌株。PCR引物為：forward:5’-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’;Reverse:5’-CCACTTCATATCTTGTAACG-3’。擴增體系為：模板3μl;引物2μl;2×Master mix 10μl; ddH2O 5μl 擴增條件為：95℃ 4min；95℃ 45S，45℃ 45S，72℃ 60S；30循環(huán),72℃ 5min。

2.菌懸液制備。分別取3株MRSA和MSSA菌株接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃，恒溫培養(yǎng)24小時。721型紫外-可見分光光度計分別進行吸光度值(600nm)測定。用肉湯培養(yǎng)基將各菌株所在菌懸液吸光度值調(diào)整至0.5 OD備用。

3.MIC測定。肉湯稀釋法[1]，用滅菌蒸餾水對各消毒劑母液做系列對倍稀釋，取各稀釋度消毒液2.5ml加入到雙倍濃度營養(yǎng)肉湯試管中，分別接種0.1ml菌懸液作為試驗組。以同樣方法接種于不含消毒劑的營養(yǎng)肉湯中作陽性對照組；另取3支無菌試管加入滅菌蒸餾水與等量雙倍肉湯混合作陰性對照組。將各組接種試管，37℃，恒溫培養(yǎng)48小時觀察結(jié)果。當陽性對照管混濁(有菌生長)，陰性對照管澄清(無菌生長)，試驗組無菌生長的最低消毒劑的濃度為MIC值。每個試驗菌株各重復3次實驗。

二、結(jié)果

(一)細菌分離與鑒定。樣本中細菌分離鑒定結(jié)果顯示：108例鼻拭紙樣本接種至顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，共有44例樣本培養(yǎng)出紅色(粉紅色)菌落，為金黃色葡萄球菌(SAU)所在菌落，SAU檢出率40.7%。提取SAU菌株基因組，經(jīng)SCCmecA基因擴增，有8株擴增出目標條帶，確定為MRSA菌株，檢出率7.4%。

(二)MIC測定結(jié)果。兩種消毒劑對MSSA和MRSA菌株的MIC測定結(jié)果表明：碘伏消毒劑對MSSA和MRSA菌株的MIC均為312.5mg/L，乙醇消毒劑對MSSA和MRSA菌株的MIC均為46,875mg/L，MRSA菌株和MSSA菌株對兩種消毒劑的最小抑菌濃度沒有明顯差別。

三、討論

消毒是預防和控制細菌感染的重要措施。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌家族攜帶的qabA/B基因可增強對其消毒劑的耐受性[2]。有報道指出，不同地區(qū)分離株各型的腸毒素基因分布存在差異[3]，對評估金黃色葡萄球菌的消毒劑抗性研究有重要意義?？v帥[4]等對徐州地區(qū)醫(yī)院住院患者送檢病原學標本分離的MRSA耐藥表型和抗消毒劑基因攜帶情況進行檢測，結(jié)果顯示，MRSA菌株中有28.0%攜帶抗消毒劑基因qacA/B,MSSA菌株中攜帶qacA/B基因僅占7.3%。表明MRSA菌株攜帶抗消毒劑基因比例明顯高于MSSA，提示MRSA和MSSA對消毒劑抗性或存在一定差異。林茹等對寧夏地區(qū)金黃色葡萄球菌的報道和沈林海等人的研究也有力地支持這一觀點[5～6]。也有報道指出，消毒劑對多種細菌的抑菌濃度并無明顯差異[7]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌攜帶的耐消毒基因qacA/B通過表達主動外排多重耐藥蛋白，從而介導對消毒劑抗性增加的現(xiàn)象[8～11]。

在校大學生作為典型的社區(qū)群體，其攜帶的金黃色葡萄球菌對常用消毒劑的抗性情況具有代表意義，可以為社區(qū)人群針對金黃色葡萄球菌的防控工作提供科學依據(jù)。本研究通過對比培養(yǎng)顯示，在校大學生群體鼻腔具有一定比例MRSA定植率，其攜帶MRSA和MSSA菌株對常用消毒劑碘伏和酒精的最小抑菌濃度無明顯差異。