免疫治療相關蛋白PD-1/PD-L1在三陰性乳腺癌中的表達及臨床意義

陶海云，屈中玉，吳艷林，蔡政

1南陽市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽 473000

2云南省中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，云南 昆明 6500210

乳腺癌是女性較常見的惡性腫瘤之一，其中三陰性乳腺癌占所有乳腺癌病理類型的10.0%～20.8%[1]。三陰性乳腺癌是指腫瘤組織免疫組織化學檢查結(jié)果為雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progestogen receptor，PR）和原癌基因人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均為陰性的乳腺癌[2]。三陰性乳腺癌具有特殊的生物學行為和臨床特征，預后較其他類型乳腺癌差[3]，因此，尋找新的治療策略，以提高三陰性乳腺癌患者的療效及改善預后至關重要。程序性死亡受體1（programmed cell death l，PDCD1，也稱PD-1）及程序性死亡受體配體 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）是近年來出現(xiàn)的一種新型免疫療法[4]，主要通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路誘導腫瘤細胞凋亡以達到治療目的[5]。相關研究表明，PD-1/PD-L1靶向治療對晚期惡性黑色素瘤具有良好的預后結(jié)果[6]，因此本研究對PD-1/PD-L1在三陰性乳腺癌中的表達情況及其臨床意義進行探討，以期為三陰性乳腺癌的臨床治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2017年12月南陽市中心醫(yī)院收治的39例三陰性乳腺癌患者的乳腺癌組織（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）存檔石蠟標本。納入標準：①經(jīng)病理學檢查確診為原發(fā)性乳腺癌；②術前均未接受放化療治療；③臨床資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤。選取同期于南陽市中心醫(yī)院行手術切除的病理診斷為非三陰性乳腺癌的39例患者的乳腺癌組織（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）石蠟標本為對照。兩組患者的年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤侵犯神經(jīng)情況及脈管內(nèi)癌栓情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。

表1 兩組患者的基本臨床特征

1.2 實驗方法

采用免疫組織化學法檢測三陰性乳腺癌組織和非三陰性乳腺癌組織中PD-1和PD-L1水平。具體方法：石蠟組織切片，經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟和水化后，用檸檬酸鹽修復液進行抗原修復，再經(jīng)過氧化氫水溶液處理，分別加入兔抗人PD-L1（稀釋比例1∶100）及PD-1抗體（過氧化氫水溶液1∶100）孵育，用新鮮配制的3，3-二氨基聯(lián)苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）溶液顯色，再將切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，最后中性樹脂封固，于400倍鏡下觀察細胞膜和（或）細胞質(zhì)的染色情況?？谷薖D-1單克隆抗體和兔抗人PD-L1單克隆抗體均購自Cell Signaling公司，DoubleStain免疫組織化學檢測試劑盒購自Abcam公司，濃縮型DAB顯色試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。

1.3 評價標準

PD-1和PD-L1染色陽性為細胞膜和（或）細胞質(zhì)呈現(xiàn)清晰的棕黃色至棕褐色顆粒，細胞不著色或細胞著色率＜5%認為是陰性表達，細胞著色率≥5%認為是陽性表達，腫瘤細胞及腫瘤間質(zhì)內(nèi)任一項陽性均為陽性表達[7]。細胞著色率為400倍視野下著色細胞數(shù)與總細胞數(shù)比值，共計數(shù)3個視野，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟-件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、PD-L1蛋白表達情況的比較

三陰性乳腺癌組織中PD-1蛋白的陽性表達率為28.21%（11/39），高于非三陰性乳腺癌組織的10.26%（4/39），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.044，P=0.044）；三陰性乳腺癌組織中PD-L1蛋白的陽性表達率為41.03%（16/39），高于非三陰性乳腺癌組織的15.38%（6/39），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.331，P=0.012）。

2.2 乳腺癌組織中PD-1、PD-L1蛋白表達情況與三陰性乳腺癌患者臨床特征的關系

不同年齡、絕經(jīng)情況、組織學分級、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤侵犯神經(jīng)情況、脈管內(nèi)癌栓情況三陰性乳腺癌患者乳腺癌組織中PD-1、PD-L1蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征三陰性乳腺癌患者乳腺癌組織中PD-1、PD-L1蛋白的陽性表達情況

3 討論

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢，嚴重影響著女性的身心健康[8]。三陰性乳腺癌是一類具有特殊生物學行為和臨床特征，且預后較其他類型差的難治性乳腺癌[9]。目前，臨床對三陰性乳腺癌患者一般僅行常規(guī)化療，這主要是因為現(xiàn)有的抗HER2治療、內(nèi)分泌治療等對三陰性乳腺癌患者的治療效果均較差[10]。但常規(guī)化療的不良反應較大，部分耐受能力差的患者無法完成整個化療周期，且化療后又極易出現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移[11]，故尋找新的有效的治療策略對三陰性乳腺癌患者的治療尤為重要。

PD-1屬于免疫共刺激分子家族成員之一，主要表達于多種免疫細胞，如成熟的T細胞、B細胞、胸腺細胞、樹突狀細胞及單核細胞等[12]。PD-L1是PD-1的重要配體之一，廣泛表達于多種淋巴組織及腫瘤組織[13]。相關研究表明，PD-1/PD-L1信號通路參與細胞凋亡及T/B細胞活化過程[14]；進一步研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1信號通路與腫瘤細胞的免疫逃逸密切相關[15]。PD-1與PD-L1結(jié)合可以抑制多種炎性因子的釋放，抑制淋巴細胞的增殖與活化，削弱機體的免疫監(jiān)視作用，從而促進腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移[16]。因此，靶向PD-1/PD-L1的腫瘤免疫療法成為近年來出現(xiàn)的一種新型腫瘤治療方法，該方法主要是通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路，誘導腫瘤細胞凋亡及破壞腫瘤免疫逃逸系統(tǒng)，從而達到腫瘤治療的目的[17]。相關研究表明，PD-1/PD-L1靶向治療對晚期惡性黑色素瘤具有良好的預后結(jié)果[18]。

本研究結(jié)果顯示，三陰性乳腺癌組織中PD-1和PD-L1的陽性表達率均高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），這提示三陰性乳腺癌組織中PD-1和PD-L1呈一致性陽性表達，推測三陰性乳腺癌患者可能從靶定PD-1/PD-L1的免疫治療中獲益。本研究進一步分析了PD-1、PD-L1表達情況與三陰性乳腺癌患者臨床特征的關系，結(jié)果顯示：PD-1、PDL1陽性表達與三陰性乳腺癌患者的年齡、絕經(jīng)情況、組織學分級、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤侵犯神經(jīng)情況及脈管內(nèi)癌栓情況無關（P＞0.05），這與Brockhoff等[19]的研究結(jié)果一致。上述結(jié)果提示，PD-1和PD-L1的表達水平可能與三陰性乳腺癌患者的病情進展無關，但三陰性乳腺癌組織中PD-1和PD-L1的陽性表達率明顯高于非三陰性乳腺癌，這提示PD-1和PD-L1有可能參與了三陰性乳腺癌的發(fā)生，檢測PD-1和PD-L1的表達對早期診斷三陰性乳腺癌可能具有積極意義，同時，阻斷PD-1和PD-L1信號通路可能成為三陰性乳腺癌潛在的治療靶點。

綜上所述，在三陰性乳腺癌中PD-1、PD-L1具有較高的陽性表達率，阻斷PD-1/PD-L1信號通路可能成為三陰性乳腺癌潛在的治療靶點，但本研究未發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1陽性表達與乳腺癌患者的臨床特征有關，這可能因為本研究納入的樣本量較少。因此，今后仍需進一步加大樣本量，以研究PD-1和PD-L1在三陰性乳腺癌中的表達情況及其與乳腺癌患者臨床特征的關系，為三陰性乳腺癌的臨床診治提供更可靠的參考依據(jù)。