阻斷STAT3信號通路對惡性淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響

姚金曉，楊如玉#，馬海龍，李超，魏旭東

1南陽市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，河南 南陽 473000

2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液科，鄭州 4500080

惡性淋巴瘤主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大，是一種起源于淋巴造血系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，由于淋巴系統(tǒng)分布較廣，淋巴瘤幾乎可以作為一種全身性疾病危害全身的組織和器官[1]。放射治療、化學(xué)藥物治療、造血干細(xì)胞治療、手術(shù)治療是目前常用的治療淋巴瘤的手段，但這些傳統(tǒng)的治療手段仍然不能滿足需求，因此，研究淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找治療淋巴瘤的有效手段十分重要[2]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是STAT家族的成員之一，能夠調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等過程，是細(xì)胞因子/生長因子信號通路傳遞過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子[3-4]。STAT3不僅在細(xì)胞正常的生長過程中具有調(diào)控作用，還參與糖尿病、腫瘤等疾病的發(fā)生過程[5-6]。本研究主要以惡性淋巴瘤細(xì)胞為研究對象，通過用JSI-124阻斷STAT3信號通路，探討STAT3信號通路在惡性淋巴瘤細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

惡性淋巴瘤細(xì)胞株Raji購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，JSI-124購自美國Sigma公司，細(xì)胞蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Thermo公司，細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）多克隆抗體、STAT3多克隆抗體、磷酸化的STAT3（p-STAT3）多克隆抗體、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteine aspartic acid protease 3，cleaved caspase 3）多克隆抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含有2 mmol/L的左旋谷酰胺、10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素、100 U/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)惡性淋巴瘤細(xì)胞Raji。培養(yǎng)3天后，1000 r/min離心10 min，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次使細(xì)胞沉淀，用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后，接種到培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）法檢測細(xì)胞增殖

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞種植到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5000個細(xì)胞。在培養(yǎng)液中加入 JSI-124，使其終濃度分別為：0、200、400、800、1600 nmol/L，每個濃度梯度設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入 10 μl的MTT，孵育 4 h。棄上清，加入150 μl的二甲基亞砜溶液，測定490 nm處各組的吸光度（absorbance，A）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（JSI-124作用組A 值÷0 nmol/L JSI-124作用組A值）×100%，采用Compusyn軟件計算半數(shù)抑制濃度。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取0、600 nmol/L的JSI-124作用48 h后的Raji細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，加入結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞后，依次加入 5 μl的 Annexin V-FITC和 PI。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平，分析凋亡率。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

取0、600 nmol/L的JSI-124作用48 h后的Raji細(xì)胞，離心，收集細(xì)胞沉淀，用-20℃預(yù)冷的70%乙醇固定，加入PI，避光染色30 min。采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.6 Western blot法檢測cyclin D1、STAT3、p-STAT3、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)

取0、600 nmol/L的JSI-124作用48 h后的Raji細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min。移液槍吸取50 μl的變性樣品至加樣孔中，用12%分離膠（120 V電壓）、5%濃縮膠（90 V電壓）電泳。4℃轉(zhuǎn)膜60 min，400 mA轉(zhuǎn)膜電流。用封閉液（5%牛血清白蛋白）室溫孵育1 h后，與一抗（1∶1000稀釋，4℃過夜）和二抗（1∶2000稀釋，室溫1.5 h）孵育后，顯色，AlphaImager成像分析，目的蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白光密度值÷GAPDH光密度值。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計-軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況的比較

隨著JSI-124作用濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸下降（表1）。計算其半數(shù)抑制濃度為（615.62±52.98）nmol/L，故后續(xù)選用600 nm/L的 JSI-124作用于惡性淋巴瘤細(xì)胞。

表1 不同濃度JSI-124作用后細(xì)胞存活率的比較（%，±s）

表1 不同濃度JSI-124作用后細(xì)胞存活率的比較（%，±s）

注：a與0 nmol/L作用組比較，P＜0.05；b與200 nmol/L作用組比較，P＜0.05；c與400 nmol/L作用組比較，P＜0.05；d與800 nmol/L作用組比較，P＜0.05

JSI-124作用濃度（nmol/L）0 200 400 800 1600 F值P值細(xì)胞存活率100.00±8.36 81.68±6.61a 65.36±5.63a b 43.15±3.51a b c 30.87±2.37a b c d 144.404 0.000

2.2 細(xì)胞凋亡情況的比較

0、600 nm/L的JSI-124作用后的細(xì)胞凋亡率分別為（9.51±1.19）%、（57.58±12.02）%。600 nm/L作用組細(xì)胞凋亡率明顯高于0 nm/L作用組（t=9.748，P＜0.01）。（圖1）

圖1 0、600 nm/L的JSI-124對細(xì)胞凋亡的影響

2.3 細(xì)胞周期情況的比較

600 nm/L作用組G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯低于0 nm/L作用組，G2/M期細(xì)胞所占比例明顯高于0 nm/L作用組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；兩組S期細(xì)胞所占比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表 2）

表2 0、600 nm-/L的JSI-124作用后各分期細(xì)胞比例的比較（%，±s）

表2 0、600 nm-/L的JSI-124作用后各分期細(xì)胞比例的比較（%，±s）

J SI-1 2 4作用濃度（n m o l/L）0 6 0 0 t值P值G 0/G 1期7 5.6 3±8.8 4 3 8.9 2±6.5 7 8.1 6 4 0.0 0 0 S期1 4.6 2±5.2 8 1 9.2 1±3.2 5 1.8 1 3 0.1 0 0 G 2/M期9.7 5±4.6 8 4 1.8 7±5.7 0 1 0.6 6 8 0.0 0 0

2.4 cyclin D1、STAT3、p-STAT3、cleaved caspase 3蛋白相對表達(dá)水平的比較

600 nm/L作用組p-STAT3、cyclin D1蛋白相對表達(dá)水平明顯低于0 nm/L作用組，cleaved caspase 3蛋白相對表達(dá)水平明顯高于0 nm/L作用組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（圖2、表3）

圖2 0、600 nm/L的JSI-124作用后cyclin D1、STAT3、p-STAT3、cleaved caspase 3蛋白的表達(dá)情況

表3 0、600nm/L的JSI-124作用后cyclinD1、STAT3、p--STAT3、cleaved caspase 3蛋白相對表達(dá)水平的比較（±s）

表3 0、600nm/L的JSI-124作用后cyclinD1、STAT3、p--STAT3、cleaved caspase 3蛋白相對表達(dá)水平的比較（±s）

JSI-124作用濃度（nmol/L）p-STAT3STAT3cyclin D1cleavedcaspase 3

3 討論

STAT3是研究較多的轉(zhuǎn)錄因子，其活躍性較高，在腫瘤中異常激活，與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡等有關(guān)[7]。STAT3蛋白具有多種功能，這是由于其含有多個功能結(jié)構(gòu)區(qū)域，主要包括DNA結(jié)構(gòu)域、保護(hù)性氨基端、SH2結(jié)構(gòu)域和STAT二聚化羧基端[8-10]。有研究表明，STAT3異?；罨螅瑫?dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[11]。JSI-124是一種三萜類化合物，能夠特異性抑制STAT3信號通路的激活，且目前無論是體外還是體內(nèi)的研究均未發(fā)現(xiàn)其毒性作用[12]。250～1000 nm/L的JSI-124作用后的膽囊癌細(xì)胞的增殖能力下降，凋亡率升高[13]。后續(xù)的研究報道稱，JSI-124還能夠抑制肝癌細(xì)胞生長，并且對白血病細(xì)胞的生長也具有抑制作用[14-15]。本研究采用Raji細(xì)胞作為研究對象，用不同濃度的JSI-124作用后，細(xì)胞的存活率呈濃度依賴性下降，細(xì)胞凋亡率明顯增高，G0/G1期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞增多。JSI-124能夠抑制惡性淋巴瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

cyclin D1是STAT3的靶基因，定位于染色體11q13，是細(xì)胞周期蛋白成員之一，也是目前研究較為深入的細(xì)胞周期蛋白[16]。cyclin D1可以與細(xì)胞中周期蛋白依賴激酶特異性結(jié)合，并使之激活進(jìn)而調(diào)控級聯(lián)信號分子在G1～S轉(zhuǎn)換期間發(fā)生磷酸化，影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[17]。cyclin D1能夠促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，是細(xì)胞周期的正調(diào)控蛋白。cyclin D1在正常的細(xì)胞中表達(dá)量較為恒定，當(dāng)其過表達(dá)后，會導(dǎo)致細(xì)胞G1期縮短，細(xì)胞增殖速度加快[18]。在腦膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、鼻咽癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)cyclin D1高表達(dá)[19]。

caspase蛋白家族參與腫瘤細(xì)胞的凋亡，是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白家族[20]。caspase 3是凋亡執(zhí)行因子，在正常情況下以酶原形式存在，當(dāng)受到外界信號刺激后被活化成cleaved caspase 3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[21]。本研究結(jié)果顯示，JSI-124作用后的惡性淋巴瘤細(xì)胞中cleaved caspase 3水平升高，cyclin D1水平下降，這與細(xì)胞周期和凋亡檢測結(jié)果一致。

綜上所述，阻斷STAT3信號通路能夠降低惡性淋巴瘤細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)惡性淋巴瘤細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，促進(jìn)caspase 3活化，降低cyclin D1表達(dá)水平。STAT3作為重要的轉(zhuǎn)錄因子信號通路，在腫瘤中的作用日益受到關(guān)注，靶向抑制其激活可能是治療腫瘤的有效方法。