骨髓間充質(zhì)干細胞源性外泌體對體外培養(yǎng)的軟骨細胞增殖和遷移的調(diào)節(jié)作用

綦惠劉丹平 田大川 肖大偉 蘇永蔚 李海樂舒雄

1北京市創(chuàng)傷骨科研究所（北京100035）

2錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院運動與關節(jié)一科（遼寧120000）

3漯河市中心醫(yī)院創(chuàng)傷骨科（河南462000）

由于軟骨細胞是關節(jié)軟骨內(nèi)唯一的細胞成分，也是軟骨組織工程的種子細胞之一，因此軟骨細胞正常生物學行為的維持是關節(jié)軟骨功能保持的必要條件。近些年來的研究證實，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）對組織損傷等病理過程的修復作用，更大程度上依賴于其對組織內(nèi)部微環(huán)境和細胞功能的調(diào)節(jié)，這一作用與其來源的外泌體（exosomes）息息相關[1-3]。外泌體是由細胞分泌的囊泡結構，其結構特點是由脂質(zhì)雙分子層包裹著多種mRNA、miRNA以及蛋白質(zhì)等小分子。外泌體是細胞與細胞之間進行交流的重要媒介，通過各種信號轉(zhuǎn)導通路，能夠發(fā)揮類似于MSCs甚至比MSCs本身更為優(yōu)異的對病變的修復作用[1-3]。研究表明，MSCs能夠調(diào)控關節(jié)腔的微環(huán)境，促進關節(jié)軟骨缺損修復[4-7]。我們既往的研究表明，MSCs與軟骨細胞共培養(yǎng)能夠促進軟骨細胞表型的維持[8]，因此我們推斷軟骨細胞生物學行為的維持很大程度上可能依賴于MSC源性外泌體。

本研究采用超高速離心的方法獲取新西蘭兔骨髓干細胞源性外泌體，將外泌體與軟骨細胞體外共培養(yǎng)，檢測其對軟骨細胞增殖和遷移的調(diào)節(jié)，以證實我們的假說。

1 材料和方法

1.1 材料

主要材料：Ⅱ型膠原酶、胰酶、低糖 DMEM和FBS購自美國Gibco公司；抗兔 CD29、CD44、CD31、CD105、CD34、CD45、CD49d、CD106、HLA-DR 抗體購自美國BD公司；Ⅱ型膠原酶、IL-1β、細胞膜Dil熒光探針、細胞核DAPI熒光探針、MTT購自美國Sigma-Al?drich公司；BCA蛋白分析試劑盒購自碧云天生物公司；CD63和CD81一抗購自英國Abcam公司，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

主要儀器：細胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國），超凈操作臺（海爾，中國），超高速離心機（日立，日本），熒光顯微鏡（Leica，德國），倒置顯微鏡（Olympus，日本），酶標儀（Biorad，美國）。

動物：清潔級成年新西蘭大白兔，雌雄不限，由北京市創(chuàng)傷骨科研究所動物室提供。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的培養(yǎng)和鑒定

采用密度梯度離心法獲取新西蘭兔的骨髓MSCs（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）。無菌條件下截取雙側中段脛腓骨，暴露骨髓腔，完全培養(yǎng)基反復快速沖洗骨髓腔，F(xiàn)icoll液分離收集細胞，離心后再次收集細胞，反復沖洗后完全培養(yǎng)基重懸，接種至培養(yǎng)皿，置于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長至80%～90%融合，對細胞進行1︰2或1︰3傳代。采用流式細胞儀對BMSCs表面抗原進行鑒定。

1.2.2 BMSCs源性外泌體的獲取和鑒定

采用傳統(tǒng)的超高速離心的方法提取BMSCs分泌的外泌體（BMSC-Exos）。將BMSCs用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)液，以2000 g離心10 min，去除細胞碎片。吸取上清液，以100，000 g離心70 min兩次，得到的沉淀即為外泌體。適量PBS重懸后，透射電鏡下對外泌體的形態(tài)進行觀察。Western blot技術進行外泌體表面抗原CD61和CD83的鑒定。

1.2.3軟骨細胞的獲取和培養(yǎng)

無菌切取若干只新西蘭兔關節(jié)軟骨并剪成碎片，置離心管中，以0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，0.2%膠原酶37℃消化90 min，吸取上清，離心收集細胞，接種至培養(yǎng)皿，置于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長至80%～90%融合，對細胞進行1︰2或1︰3傳代。取第2代或第3代軟骨細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4 軟骨細胞增殖的檢測

采用MTT法檢測軟骨細胞增殖。軟骨細胞接種在96孔板。待軟骨細胞長至80%～90%融合時，將完全培養(yǎng)基替換成含有40 μg/mL、80 μg/mL、120 μg/mL 外泌體的PBS或不含外泌體的PBS。不同含量的BMSCExos與軟骨細胞共培養(yǎng)4 h、8 h、16 h、24 h、48 h。在培養(yǎng)結束前4 h，每孔加入5 μg/mL MTT 20 μL。培養(yǎng)時間結束時，吸去上清，加入150 μL DMSO溶解結晶，水平振搖10 min后，酶標儀570 nm檢測吸光度。

模擬骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）關節(jié)腔炎性環(huán)境，在軟骨細胞培養(yǎng)基中加入10 ng/mL IL-1β，或者同時加入外泌體，MTT法檢測軟骨細胞增殖的變化。

1.2.5 軟骨細胞攝取BMSC-Exos的檢測

待軟骨細胞長至80%～90%融合時，用PBS沖洗細胞，將完全培養(yǎng)基置換成不含血清的培養(yǎng)基。Dil加入到BMSC-Exos中，100，000 g離心2 h，用不含血清的培養(yǎng)基重懸之后，加入軟骨細胞中，共培養(yǎng)2 h、4 h和8 h。之后，將采用4%多聚甲醛對軟骨細胞進行固定15 min，DAPI染色5 min，PBS沖洗后，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 軟骨細胞遷移的檢測

采用劃痕試驗對軟骨細胞的遷移能力進行檢測。軟骨細胞接種至六孔板中，待細胞鋪滿孔底，用200 μL無菌微量移液器槍頭沿著六孔板的孔中央進行劃痕，PBS漂洗掉細胞殘渣，新的不含血清的培養(yǎng)基（含有或不含有BMSC-Exos）加入六孔板中，再培養(yǎng)24 h。每孔設置3個復孔。倒置相差顯微鏡下進行觀察，并測量劃痕兩側距離，與0 h對比后，計算劃痕愈合率。

1.2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗；多組均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1 BMSCs的鑒定

本研究成功地從新西蘭兔的骨髓中獲取了BM?SCs。流式細胞術檢測結果顯示，多數(shù)BMSCs表達CD29、CD44、CD49d和CD105，而低表達CD34、CD45、CD106和HLA-DR（圖1）。表達值分別為CD29 98.3%、CD44 97.6%、CD49d 86.7%、CD105 95.4%、CD34 32.6%、CD45 17.4%、CD106 15.8%、HLA-DR 27.6%。

圖1 流式細胞術檢測BMSCs的表面標記

2.2 BMSC-Exos的鑒定

采用透射電鏡對BMSC-Exos的形態(tài)學進行觀察。電鏡下，外泌體呈近似球形，直徑40～100 nm。West?ern blot檢測表明，與既往研究者的結果一致[9，10]，本研究提取的外泌體表達CD63和CD81（圖2）。

圖2 BMSC-Exos的鑒定

2.3 BMSC-Exos能夠促進軟骨細胞增殖

為觀察外泌體對軟骨細胞生物學行為的作用，本研究將不同濃度的BMSC-Exos與軟骨細胞在體外進行共培養(yǎng)，結果顯示，40 μg/mL、80 μg/mL和120 μg/mL含量的BMSC-Exos均可顯著促進軟骨細胞增殖（P＜0.05），80 μg/mL和120 μg/mL外泌體的作用沒有顯著差異（圖3）。后續(xù)實驗均采用80 μg/mL進行。

圖3 MTT法檢測BMSC-Exos對軟骨細胞增殖的作用

2.4 BMSC-Exos能夠被軟骨細胞攝取

由于BMSC-Exos能夠促進軟骨細胞增殖，本研究進一步采用熒光顯微鏡觀察軟骨細胞攝取BMSC-Exos的情況。如圖4所示，BMSC-Exos被Dil標記為紅色，軟骨細胞的細胞核被DAPI標記為藍色。通過熒光顯微鏡，觀察到紅色標記的BMSC-Exos能夠被軟骨細胞攝取，且在共培養(yǎng)8 h的時候，BMSC-Exos主要集中在軟骨細胞的細胞核周邊。

圖4 熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞對BMSC-Exos的攝取

2.5 BMSC-Exos能夠促進軟骨細胞遷移

如圖5和表1所示，軟骨細胞培養(yǎng)24 h后，劃痕愈合率約44%，當給予軟骨細胞BMSC-Exos共培養(yǎng)24 h后，劃痕間距明顯減小，劃痕愈合率上升至約63%，愈合率顯著升高（P＜0.05）。

表1 劃痕愈合率（%，均數(shù)±標準差）

圖5 BMSC-Exos對軟骨細胞遷移的影響

2.6 BMSC-Exos抑制IL- 1β 誘導的軟骨細胞增殖能力下降

IL-1β是OA的重要前炎癥細胞因子。因此在軟骨細胞培養(yǎng)體系中加入BMSC-Exos和IL-1β，觀察BM?SC-Exos對軟骨細胞的保護作用。如圖6所示，IL-1β能夠時間依賴性抑制軟骨細胞的增殖（P＜0.05），而BMSC-Exos能夠完全逆轉(zhuǎn)IL-1β的作用。

圖6 IL-1β刺激下BMSC-Exos對軟骨細胞增殖的檢測

3 討論

外泌體是由細胞分泌的，脂質(zhì)雙分子層包裹的，含有mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)等多種小分子的囊泡。幾乎所有細胞均可產(chǎn)生外泌體，如免疫細胞、上皮細胞、干細胞、腫瘤細胞等[11，12]。

隨著研究的進展，細胞治療逐漸受到重視。由于低免疫原性和多向分化潛能，MSCs移植越來越多地被嘗試應用于臨床。但是，移植到損傷部位的MSCs僅有少部分存活，且MSCs移植有可能引起長期異常分化和腫瘤形成[1-3]，這些潛在的安全風險和未知因素極大地限制了MSCs的廣泛應用。近些年來，研究者們更傾向于認為MSCs促進損傷修復的機制主要是一種間接的、依賴于旁分泌的方式，而MSCs源性外泌體（MSCs de?rived exosomes，MSC-Exos）可能是其中的關鍵作用組件[1-3]。MSC-Exos參與調(diào)控多個病理過程，如可明顯降低心肌缺血再灌注過程中的炎癥反應，減輕心肌損傷[13]；抑制缺氧誘導的小鼠肺動脈高壓模型的肺部炎癥反應[14]；作用于白血病患者血液中的細胞可明顯增強抗炎因子IL-10、TGF-β的表達，降低促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的表達[15]。我們既往的研究表明，MSCs與軟骨細胞共培養(yǎng)能夠促進軟骨細胞表型的維持[8]，但是具體機制仍是未知的，且目前MSC-Exos在軟骨損傷修復中的作用研究較少。

關節(jié)軟骨缺損如未得到及時處理，會逐漸擴大至周圍正常軟骨，造成進一步磨損，是引發(fā)骨關節(jié)炎（os?teoarthritis，OA）的重要原因之一。我國OA患者約有1億人，且呈不斷增加趨勢，由于極高的患病率和致殘率，以及昂貴的治療費用，OA已成為造成經(jīng)濟損失和影響社會發(fā)展的主要疾病之一。目前臨床治療軟骨缺損的常用方法如關節(jié)腔灌洗術、微骨折術、自體/異體軟骨移植等，旨在減輕關節(jié)疼痛和緩解癥狀，長期治療效果仍較為局限[4-7]。以MSCs為基礎的細胞治療已證實具有較好療效，但是MSCs向軟骨組織定向分化的各種因素是十分復雜的，同時也面臨著畸胎瘤[16]形成的風險。已有的研究表明，MSC-Exos能有效促進OA患者關節(jié)軟骨缺損的修復[17]，因此研究者們推測MSCExos有望替代MSCs成為關節(jié)軟骨缺損/OA的輔助治療新策略。

我們采用超高速離心法獲取骨髓MSCs來源的外泌體（BMSC-Exos），通過透射電鏡觀察BMSC-Exos呈近似球形，Western blot鑒定BMSC-Exos表面表達CD63和CD81。將不同含量的BMSC-Exos與軟骨細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BMSC-Exos的作用類似于生長因子，能夠時間和劑量依賴性促進軟骨細胞增殖。共培養(yǎng)4 h，BMSC-Exos即有明顯的促增殖作用，但120 μg/mL的作用與80 μg/mL相比無顯著差異。因此，后續(xù)實驗我們均采用80 μg/mL的劑量。熒光染色實驗進一步證實，體外共培養(yǎng)環(huán)境中，軟骨細胞能夠攝取BMSCExos，且在共培養(yǎng)4 h，發(fā)現(xiàn)帶有紅色熒光的BMSCExos位于軟骨細胞周圍，共培養(yǎng)8 h，發(fā)現(xiàn)大量紅色熒光聚集在帶有藍色熒光的軟骨細胞核周邊，表明可能在共培養(yǎng)的更早期BMSC-Exos即向軟骨細胞遷移。

在正常關節(jié)液中含有少量IL-1β，而OA患者的關節(jié)液中IL-1β濃度顯著升高[18，19]，并且OA患者的軟骨細胞表面IL-1受體的表達量是正常人軟骨細胞的2倍，這就造成了OA患者的軟骨細胞對IL-1β的高反應性。研究通過轉(zhuǎn)染技術使抗IL-l受體拮抗蛋白在病變的關節(jié)內(nèi)高表達，結果發(fā)現(xiàn)IL-1β的破壞作用明顯減弱[19]，這些變化說明OA的發(fā)生伴隨著IL-1β表達量升高，IL-1β的高表達在OA的發(fā)展過程中起著極其重要的作用。本研究采用IL-1β作為前炎癥因子刺激軟骨細胞，與既往研究者的結果類似[20，21]，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞增殖受到明顯抑制。當給予BMSC-Exos同時作用，軟骨細胞降低的增殖能力得到完全逆轉(zhuǎn)。這提示，OA患者的關節(jié)腔中給予BMSC-Exos注射治療可能改善患者受損軟骨細胞的增殖功能。張長青[10]團隊的研究表明，滑膜干細胞源性外泌體能夠增強軟骨細胞的增殖和遷移，與該研究結果一致，本研究通過劃痕試驗發(fā)現(xiàn)，BMSCExos體外能夠促進軟骨細胞遷移。

4 結論

MSCs源性外泌體具有與MSCs本身類似的促進軟骨細胞增殖和遷移的作用，如能進一步確證該作用，則將是MSCs源性外泌體能夠作為非細胞治療方法應用于關節(jié)軟骨缺損/骨關節(jié)炎的有力佐證。