慢性腦缺血大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α及β-淀粉樣蛋白1-42的表達研究

金平 王經(jīng)英 邢小煒 林敏 蔡兆偉 許茂盛 孫志超 佟雅涵

阿爾茨海默?。ˋD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，具有病因多樣、起病隱匿、認知功能隨病程進展?jié)u進性損害等特點。腦部出現(xiàn)老年斑（SPs）是AD的主要病理變化之一，其核心成分是β-淀粉樣蛋白（Aβ），尤其是Aβ1-42在AD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1]。關(guān)于AD的病因研究一直是臨床的熱點[2]。有研究指出，免疫炎性反應、慢性腦缺血在AD的病情進展中發(fā)揮重要作用[3]。筆者團隊早期研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食喂養(yǎng)的AD兔模型中，繼發(fā)于高脂血癥的低血流量灌注與腦組織Aβ1-42的沉積存在明顯的相關(guān)性[4]。因此，筆者有理由假設(shè)免疫炎性反應與慢性腦缺血所導致的腦組織Aβ1-42異常沉積有密切關(guān)系。本研究通過建立慢性腦缺血大鼠模型，檢測其腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子和Aβ1-42的表達水平，分析兩者的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物來源 選用健康成年普通級雄性SD大鼠 16 只，24周齡，體重（180±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心普通級大鼠實驗室[SYXK（浙）2013-0184]提供并飼養(yǎng)于標準籠內(nèi)，12h/12h明暗交替，飼養(yǎng)溫度22～23℃，相對濕度45%～50%，自由飲食。

1.2 實驗動物分組和處理 將16只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組和假手術(shù)組，各8只。模型組：使用3%戊巴比妥鈉，按45mg/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，永久結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈建立慢性腦缺血大鼠模型[5]。手術(shù)中使用電熱毯維持大鼠肛溫在（37.0±0.5）℃，手術(shù)后大鼠送至有通風和空調(diào)設(shè)備的動物房飼養(yǎng)，術(shù)后3d連續(xù)肌肉注射青霉素20萬U/kg體重，以預防感染。假手術(shù)組：采用與模型組相同的方法麻醉大鼠，切開其頸部皮膚后分離雙側(cè)頸總動脈，但不結(jié)扎，后續(xù)處理同模型組。

1.3 大鼠局部腦血流（rCBF）檢測 使用激光多普勒血流儀分別檢測兩組大鼠手術(shù)前、手術(shù)后（30min內(nèi)）海馬CA1區(qū)rCBF變化情況，測量點定于大鼠右側(cè)外眥與耳孔連線的中點（對應顱內(nèi)右側(cè)顳葉海馬區(qū)域）。具體測量步驟見參考文獻[6]。

1.4 大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 Aβ1-42表達水平檢測 術(shù)后4周兩組大鼠均使用3%戊巴比妥鈉按45mg/kg腹腔注射麻醉后斷頭處死，再次確認模型組大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎情況，確保結(jié)扎絲線沒有滑脫或松弛，頸總動脈被牢固結(jié)扎。取出大鼠腦組織并分離海馬，使用均質(zhì)機（法國Birtin公司）制備10%的腦組織勻漿，4℃環(huán)境下3 000r/min離心10min，取上清液進行ELISA法檢測。使用上海巧伊生物科技有限公司提供的IL-1β、IL-6和TNF-α試劑盒以及南京建成生物工程研究所提供的Aβ1-42試劑盒檢測IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ1-42表達水平。測量步驟嚴格按照使用說明書進行。

1.5 觀察指標 （1）比較兩組大鼠手術(shù)前后rCBF；（2）比較兩組大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 Aβ1-42表達水平；（3）分析大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 表達水平與Aβ1-42表達水平的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件；計量資料以 表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內(nèi)手術(shù)前后比較采用配對t檢驗；相關(guān)性分析采用Person相關(guān)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠手術(shù)前后rCBF比較 見表1。

表1 兩組大鼠手術(shù)前后rCBF比較（ml/min）

由表1可見，手術(shù)前兩組大鼠rCBF比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），手術(shù)后模型組大鼠rCBF明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）。模型組大鼠手術(shù)后rCBF明顯低于手術(shù)前（P＜0.05），而假手術(shù)組大鼠手術(shù)前后rCBF比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.2 兩組大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α和 Aβ1-42表達水平比較 見表2。

由表2可見，模型組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子表達水平均高于假手術(shù)組，Aβ1-42表達水平亦高于假手術(shù)組，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.3 大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平與Aβ1-42表達水平的相關(guān)性分析 見圖1-3。

表2 兩組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ1-42表達水平比較

圖1 大鼠腦組織IL-1β表達水平與Aβ1-42表達水平的散點圖

圖2 大鼠腦組織IL-6表達水平與Aβ1-42表達水平的散點圖

圖3 大鼠腦組織IL-6表達水平與Aβ1-42表達水平的散點圖

由圖 1-3可見，大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 表達水平與Aβ1-42表達水平均呈正相關(guān)（r=0.7755、0.5920、0.5536，均P＜0.05）。

3 討論

慢性腦缺血是指因各種原因所引起的慢性腦血流灌注不足導致的一組疾病，是AD等導致認知功能障礙疾病的共同病理基礎(chǔ)[7]。目前學界普遍認為AD是一種神經(jīng)退行性疾病，但長時間的腦部低血流灌注會促使AD的發(fā)生。Torre[8]提出AD的臨界腦低血流灌注閾值學說，指出當腦血流灌注因為各種原因降至一定的閾值以后，便可以通過觸發(fā)級聯(lián)反應，使腦組織出現(xiàn)一系列的類似AD的病理改變。早有研究指出，通過結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈所建立的慢性腦缺血大鼠模型與散發(fā)性AD患者在認知功能的損傷、腦血管的異常改變和神經(jīng)元變性等諸多方面的存在相似[5，8]。研究者還在慢性腦缺血動物模型腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)Aβ和淀粉樣前體蛋白（APP）濃度明顯上升[9-10]，而腦組織的Aβ，尤其是Aβ1-42的異常增高和沉積是AD的特征性主要病理改變之一。

參考Smith等[11]提出的AD腦萎縮假說，筆者團隊采用雙側(cè)頸動脈結(jié)扎的方法成功制備大鼠腦缺血模型，檢測兩組大鼠腦組織Aβ1-42表達水平。結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織Aβ1-42水平較假手術(shù)組大鼠明顯升高，與以往研究結(jié)果相符[9-10]。慢性腦缺血可以在提高β-分泌酶活性強化APP的淀粉樣途徑的同時，降低α-分泌酶活性，從而使非淀粉樣途徑受到抑制，最終使Aβ蛋白生成增加[10]。Ballabh等[12]指出腦缺血可以使糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)蛋白表達明顯增多，RAGE通過內(nèi)吞或跨膜作用，將腦組織外的Aβ通過血腦屏障轉(zhuǎn)運入腦，使腦組織的Aβ表達水平增高。沉積在小動脈與毛細血管基膜上的Aβ則通過增強內(nèi)皮素的縮血管作用引起腦組織供血動脈和毛細血管收縮，進一步加重腦的低血流灌注，從而發(fā)生互相促進的惡性循環(huán)[13]。

神經(jīng)免疫炎性反應被認為是慢性腦缺血發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，發(fā)生慢性腦缺血時，顱內(nèi)的神經(jīng)免疫炎性細胞星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞等出現(xiàn)增生和活化，活化后的膠質(zhì)細胞既對神經(jīng)元有支持和營養(yǎng)作用，又因分泌大量的TNF-α、IL-1、IL-6等免疫炎性因子而進一步加劇神經(jīng)免疫炎性反應，使神經(jīng)元損傷加重[14-15]。本研究結(jié)果顯示，慢性腦缺血模型大鼠腦組織的IL-1β、IL-6和TNF-α等免疫炎性因子表達水平較假手術(shù)組明顯增高，這與有關(guān)研究的結(jié)果相符[14]。

免疫炎性反應貫穿了AD的整個發(fā)生、發(fā)展過程[16]。Aβ蛋白在腦組織中異常沉積可形成神經(jīng)炎性斑（SPs）。SPs形成過程中其周圍總是存在神經(jīng)膠質(zhì)細胞的明顯增生、活化以及免疫炎性因子的分泌，提示Aβ可以誘導包括小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞的活化，促使其釋放炎性因子和神經(jīng)元毒性介質(zhì)，導致神經(jīng)元損害[17]。本研究結(jié)果顯示，大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子表達水平與Aβ1-42表達水平均呈正相關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1是AD神經(jīng)免疫炎性反應的標志物，在整個炎性反應過程中發(fā)揮著重要的作用，而且與AD的病情嚴重程度存在明顯的相關(guān)性[18]。IL-1有IL-1α和IL-1β兩種，其中IL-1β的過表達和過度釋放是AD免疫炎性損傷的起始因素[19]。過表達的IL-1β不僅可以通過蛋白激酶C（PKC）途徑促進APP的合成和裂解[20]，加速腦內(nèi)Aβ的形成和沉積，還可使環(huán)氧化酶（COX1、COX2）合成增多[21]，進而誘導神經(jīng)元凋亡，導致患者認知功能損傷。

TNF-α的過表達也與AD存在明顯的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血和腦脊液TNF-α表達水平較正常人群明顯升高[22]；TNF-α的過表達可以加速Aβ形成和沉積，導致認知功能損傷[23]。TNF-α不僅可以通過激活Caspases家族成員引起神經(jīng)元凋亡，還可以誘導花生四烯酸代謝物的釋放、脂質(zhì)過氧化物和氧自由基的產(chǎn)生，破壞細胞膜，導致細胞凋亡；此外TNF-α還可以協(xié)同IL-1β誘導IL-6等其他細胞因子的產(chǎn)生[24]。

IL-6在AD疾病起始階段就可以出現(xiàn)升高，是AD發(fā)病的的危險因素[25]。IL-6主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞合成，可以刺激小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞釋放炎性因子。IL-6可以通過促使神經(jīng)元APP mRNA表達升高，從而使APP生成增加[26]；還可以通過誘導α2巨球蛋白合成，抑制腦組織Aβ的清除，導致腦組織Aβ的異常沉積。此外，Qiu等[27]發(fā)現(xiàn)IL-6還與Aβ在AD的疾病進展中存在協(xié)同促進作用。

綜上所述，慢性腦缺血大鼠腦組織存在IL-1β、IL-6和TNF-α等免疫炎性因子表達水平與Aβ1-42表達水平升高的現(xiàn)象，且免疫炎性因子表達水平與Aβ1-42表達水平呈正相關(guān)。慢性腦缺血或可促使腦組織Aβ1-42表達水平上升和異常沉積，免疫炎性反應或與慢性腦缺血所導致的腦組織Aβ1-42異常沉積有關(guān)。當然，本研究也存在不足之處，如未對兩組大鼠進行行為學比較，未對大鼠腦內(nèi)是否存在AD的特征性病理改變進行觀察，筆者團隊將在今后作進一步研究和更深入的探討。