黃芪甲苷抑制粘著斑激酶磷酸化改善高糖環(huán)境下的足細胞黏附能力的研究

何東元 鄭志貴 陳宜方 陳建國

糖尿病腎病是終末期腎病患者的首要病因，而足細胞損傷是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。既往研究顯示，糖尿病患者早期就可出現(xiàn)足細胞黏附功能下降，足細胞脫落，導(dǎo)致腎小球基底膜裸露，加速糖尿病腎病進展[2]。粘著斑激酶（FAK）在細胞黏附和遷移中發(fā)揮重要作用，若缺乏FAK，細胞遷移能力會出現(xiàn)顯著降低，且FAK磷酸化可改變細胞的黏附能力[3]。有不少研究顯示，傳統(tǒng)中藥黃芪的重要活性成分黃芪甲苷（AS-IV）對足細胞具有保護作用[4-6]，但作用機制尚未完全闡明?；诖?，本研究旨在觀察AS-IV對高糖環(huán)境下足細胞黏附能力的影響，并探討其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 條件永生化小鼠足細胞（浙江醫(yī)院實驗室）；AS-IV 單體（TLC純度 98%）、D-葡萄糖和 γ-IFN（美國Sigma公司）；FBS、青霉素、鏈霉素和RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；抗FAK抗體、抗磷酸化FAK（p-FAK）抗體、抗GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗和ECL化學(xué)發(fā)光劑（美國Santa Cruz公司）；RAPA蛋白裂解緩沖液（中國上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；BCA試劑盒（美國Pierce公司）；Transwell-Col PTFE過濾器（3μm孔，美國Corning公司）；細胞黏附熒光定量試劑盒（美國Calbiochem公司）；Bio-Rad 2000凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；FlexStation 3熒光讀板儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組 條件永生化小鼠足細胞生長在RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素）中。在33℃、10U/ml γ-IFN條件下傳代，在37℃、無γ-IFN條件下誘導(dǎo)分化。分化后的足細胞用1%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)24h同步化后分為以下4組。正常對照組（Con組）：D-葡萄糖 5mmol/L；高糖組（HG組）：D-葡萄糖30mmol/L；高糖+低劑量AS-IV組（HG+LD 組）：D-葡萄糖 30mmol/L+AS-IV 50mg/L；高糖+高劑量AS-IV組（HG+HD組）：D-葡萄糖30mmol/L+ASIV 100mg/L。

1.2.2 足細胞黏附能力測定 使用細胞黏附熒光定量試劑盒檢測足細胞黏附能力。分化的足細胞種植在分別鋪有基底膜復(fù)合物（BMC）、小牛血清白蛋白（陰性對照）和多聚賴氨酸（陽性對照）的96孔培養(yǎng)板中，按上述分組進行干預(yù)。各組于干預(yù)3、6、12和24h后分別隨機選取24孔棄去培養(yǎng)液，每孔200μl PBS沖洗2次除去未黏附的細胞，每孔加入100μl熒光Calcein-A M工作液，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1h，熒光讀板儀（FlexStation 384）上檢測每孔相對熒光強度（RFU），激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長520 nm。RFU值越大，說明黏附的細胞數(shù)量越多，細胞黏附能力越強。

1.2.3 白蛋白流量率檢測法測定足細胞單層屏障功能（單層滲漏白蛋白濃度） 5×105個分化的足細胞接種于Ⅰ型膠原包被Transwell上室（3μm孔），不同條件下培養(yǎng)48h。丟棄培養(yǎng)液，用含1mmol/L CaCl2和1mmol/L MgCl2的PBS洗2次。然后，上室填充0.15ml的RPMI 1640，底腔填充1ml含40mg/ml小牛血清白蛋白的RPMI 1640培養(yǎng)液37℃孵育6h。BCA試劑盒檢測上室培養(yǎng)液白蛋白濃度。

1.2.4 Western blot法檢測FAK與p-FAK表達 各組細胞干預(yù)24、48h后，蛋白裂解液裂解各組細胞，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，2%小牛血清白蛋白的TBST室溫封閉60min，加入抗FAK、抗p-FAK和抗GAPDH抗體4℃孵育24h，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育60min，ECL發(fā)光劑在X線片上曝光顯影。Bio-Rad 2000凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度。實驗重復(fù)3次，得出目的蛋白與GAPDH光密度比值作為目的蛋白表達水平。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較（1）4組足細胞黏附能力；（2）4組足細胞單層屏障功能；（3）4組足細胞FAK與p-FAK表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SigmaStat 12.0統(tǒng)計軟件；計量資料以 表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組足細胞黏附能力比較 見圖1。

圖1 4組足細胞黏附能力比較

由圖1可見，干預(yù)12h后，4組足細胞黏附能力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），干預(yù) 3、6、12、24h 后，Con、HG、HG+HD組足細胞黏附能力比較差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。即高糖環(huán)境會降低足細胞的黏附能力，而AS-IV可明顯增強高糖環(huán)境下足細胞的黏附能力，且該作用具有時間和劑量依賴性。

2.2 4組足細胞單層屏障功能比較 見圖2。

圖2 4組足細胞單層屏障功能比較

由圖2可見，4組足細胞單層屏障功能比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。即高糖環(huán)境會降低足細胞單層屏障功能，而AS-IV可劑量依賴性地增強高糖環(huán)境下足細胞單層屏障功能。

2.3 4組足細胞FAK與p-FAK表達情況比較 見圖3。

圖3 4組足細胞FAK與p-FAK表達情況比較

由圖3可見，干預(yù)24、48h后，4組足細胞FAK表達情況比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），p-FAK表達情況比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。即高糖環(huán)境對足細胞FAK表達無明顯影響，但會明顯增加FAK磷酸化；AS-IV可明顯抑制高糖環(huán)境下足細胞FAK蛋白磷酸化，且該作用具有時間和劑量依賴性。

3 討論

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為黃芪具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫等功效。黃芪用于治療糖尿病和腎臟疾病已有上千年的歷史[4]。AS-IV是黃芪主要活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎癥因子、抗間質(zhì)纖維化、抗凋亡和抗氧化應(yīng)激等多方面藥理作用。AS-IV被2005版《中國藥典》納作評估黃芪藥材質(zhì)量的指標(biāo)。既往研究顯示，AS-IV可通過抑制PERK-ATF4-CHOP信號通路抑制高糖環(huán)境下足細胞凋亡[5]，抑制NF-κB改善糖尿病大鼠足細胞足突融合，降低蛋白尿[6]，但AS-IV對足細胞的保護作用機制尚未完全闡明。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，足細胞數(shù)量減少和/或功能障礙與蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。高糖環(huán)境下足細胞黏附能力減弱是足細胞從腎小球基底膜脫落的重要原因，也是早期糖尿病腎病進展的重要原因[1]。足細胞是終末分化細胞，幾乎沒有增殖能力[7]。足細胞脫落或壞死將導(dǎo)致足細胞數(shù)量不可逆性減少，基底膜裸露，腎小球壁層上皮細胞和裸露的基底膜粘連，最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎臟功能衰竭[8]。研究顯示，1型糖尿病和2型糖尿病早期均有足細胞脫落和數(shù)量減少現(xiàn)象[9]。減少足細胞脫落可能成為未來糖尿病腎病治療的靶點。本研究采用細胞黏附熒光定量試劑盒檢測足細胞和BMC之間的黏附能力，采用白蛋白流量率檢測法檢測足細胞單層屏障功能。結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下足細胞與BMC之間的黏附能力明顯下降，足細胞單層屏障功能明顯下降，而AS-IV干預(yù)可增強高糖環(huán)境下足細胞黏附能力，增強足細胞單層屏障功能，其作用具有時間和劑量依賴性。

FAK是一種非受體絡(luò)氨酸激酶，在細胞黏附中起重要作用。目前認為FAK和β整合素直接相連，是整合素信號傳導(dǎo)的中樞介質(zhì)，也是其他細胞表面受體信號傳遞的重要組成部分[10]。FAK磷酸化是整合素、生長因子和細胞外基質(zhì)蛋白啟動的信號通路中的早期事件，F(xiàn)AK調(diào)節(jié)細胞遷移在許多類型細胞中已被證實。表皮傷口愈合過程中遷移的角質(zhì)形成細胞FAK表達或激活增加，在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞遷移過程中也觀察到相同現(xiàn)象[11-12]。FAK在腎臟發(fā)育和細胞分化中起重要作用。FAK基因敲除的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的中胚層缺陷，在胚胎早期死亡[13]。FAK沉默的成纖維細胞遷移能力嚴(yán)重缺陷[14]。抑制FAK磷酸化可導(dǎo)致成纖維細胞和內(nèi)皮細胞遷移能力下降，過度表達FAK可導(dǎo)致多種細胞遷移能力增加[15]。既往研究顯示，足細胞表達FAK，足細胞損傷后FAK磷酸化增加。FAK磷酸化后可以激活多個下游信號通路，其中FAK/p38 MAPK通路是重要的一條。p38 MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，在炎癥、氧化應(yīng)激、衰老、自噬以及細胞凋亡中均有重要作用[16]。FAK/p38 MAPK通路參與阿霉素[17]和轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的足細胞損傷[18]。足細胞特異性敲除FAK基因或藥物抑制FAK/p38 MAPK信號通路可緩解蛋白尿和足細胞足突融合[17，19]。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果相符，高糖環(huán)境對足細胞FAK表達無明顯影響，但會明顯增加FAK磷酸化；AS-IV可明顯抑制高糖環(huán)境下足細胞FAK蛋白磷酸化，且該作用具有時間和劑量依賴性。

綜上所述，AS-IV可能通過抑制FAK磷酸化改善高糖環(huán)境下足細胞的黏附能力。本研究結(jié)果或?qū)樘悄虿∧I病的早期治療提供理論參考。