有機(jī)氮源及其在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用

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(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457)

生物體的生存離不開環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，微生物也不例外，只有在營養(yǎng)條件適宜的條件下，微生物才能順利地生長繁殖。微生物生長離不開碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子和水等五大營養(yǎng)因素[1]。氮源的主要作用是維持胞內(nèi)需氮化合物的合成，比如氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等。氮源按物質(zhì)性質(zhì)的不同分為兩大類：無機(jī)氮源和有機(jī)氮源。因無機(jī)氮源發(fā)揮作用快，可迅速被細(xì)胞分解吸收，稱為速效氮源，可滿足微生物生長初期的氮源需求，包括各種銨鹽、硝酸鹽和氨水等[2]。有機(jī)氮源包括蛋白胨、玉米漿和各種有機(jī)粉餅等物質(zhì)，如酵母浸粉、花生餅粉、黃豆餅粉和棉子餅粉等[3]。有機(jī)氮源含有豐富的氨基酸、維生素及生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，其中氨基酸可以直接參與微生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨或脫氨作用[4]，維生素可以作為一些酶的輔因子參加胞內(nèi)生命活動，只有某些微生物可以利用嘌呤和嘧啶，如尿素發(fā)酵梭菌[5]。有機(jī)氮源只有被細(xì)胞水解后才會發(fā)揮作用，水解過程比較緩慢，細(xì)胞對蛋白的利用速度也比較慢，所以這類氮源常被稱為遲效氮源[2]。在微生物培養(yǎng)過程中，無機(jī)氮源與有機(jī)氮源總是相互配合發(fā)揮作用。按一定比例將二者加入培養(yǎng)基中，無機(jī)氮源可滿足前期微生物的快速生長，有機(jī)氮源則可以滿足微生物中后期生長及產(chǎn)物積累。

1 幾種常用的有機(jī)氮源

酵母粉分為天然酵母粉和酵母浸粉，天然酵母粉主要由多種酵母菌自然繁殖而成，因酵母菌大部分附著在果實、谷物和花上，所以天然酵母粉的營養(yǎng)物質(zhì)主要由附著物決定，是一種純天然、無污染的健康營養(yǎng)源[6]。酵母浸粉是由人工制備的酵母粉，是在一定條件下，將面包酵母或啤酒酵母自溶和酶法破壁，將蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)充分釋放、降解，最后經(jīng)濃縮或干燥制成的更容易被吸收的膏狀或粉狀物質(zhì)[7]。

蛋白胨，由多種氨基酸和多肽構(gòu)成，制作原料主要是肉、酪素或明膠等，是利用生物手段將原料水解后濃縮干燥而成的一種淺黃色粉末。從來源分，蛋白胨可分為動物性蛋白胨、植物性蛋白胨和微生物蛋白胨。動物性蛋白胨包括胰胨、肉胨和骨胨等，大豆蛋白胨屬于植物性蛋白胨，酵母蛋白胨屬于微生物蛋白胨。蛋白胨含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，被視為微生物生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、微生物發(fā)酵和科研等領(lǐng)域，因不同生物體生長所需的氨基酸與多肽等營養(yǎng)物質(zhì)不同，每種蛋白胨所含的營養(yǎng)物質(zhì)也有差別，因此科學(xué)使用蛋白胨也是一門技術(shù)。

與酵母浸出物、蛋白胨和豆粕水解液等有機(jī)氮源相比，玉米漿可被視為最廉價的有機(jī)氮源。玉米漿是濕磨法生產(chǎn)玉米淀粉的副產(chǎn)物，富含糖類、可溶性蛋白質(zhì)、氨基酸和多肽等營養(yǎng)物質(zhì)[8]，其氨基酸、維生素和生長因子的種類和含量明顯高于酵母浸出物及蛋白胨，不僅有利于菌體生長，還可以提高發(fā)酵產(chǎn)酸和糖酸轉(zhuǎn)化率。

2 常用有機(jī)氮源及其應(yīng)用

氮源的來源和批次不同，其成分會有一定的差異，對微生物發(fā)酵及產(chǎn)酸都有影響。因此，對氮源進(jìn)行篩選時，將原料來源及生產(chǎn)廠家資質(zhì)視為嚴(yán)格把關(guān)的環(huán)節(jié)，對提高生產(chǎn)水平，降低生產(chǎn)成本具有指導(dǎo)意義[5]。

腺嘌呤是酵母浸粉成分之一，肌苷合成需要大量腺嘌呤，因此在肌苷合成過程中，酵母浸粉被視為腺嘌呤供體，對細(xì)胞生長及肌酐合成均有一定的正向或負(fù)向影響。吳敏芝等[9]探索了一系列濃度梯度的酵母浸粉的添加對肌苷積累的影響，從而確定酵母浸粉添加量為1.6%～1.8%時，最有利于肌苷的積累，過高或過低對肌苷的積累都是不利的。李建國等[10]在利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的研究中，探索了酵母浸粉對核黃素積累的影響，適量的酵母浸粉可為核黃素的積累提供氮源及生長因子，酵母浸粉中某些可溶性組分的過量存在，會造成碳流阻滯，降低核黃素的合成速率和產(chǎn)量。

蛋白胨種類繁多，每種蛋白胨中含有的營養(yǎng)成分會有所差別，每種微生物所需的營養(yǎng)源也不盡相同，因此為特定的菌種尋找最適的蛋白胨來滿足細(xì)胞生長顯得尤為重要。邱玉棠等[11]在以枯草芽孢桿菌積累肌苷的研究中，選擇了兩種來源不同的蛋白胨添加入培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，兩類蛋白胨在細(xì)胞形態(tài)和肌苷積累等方向的效果有明顯差異，最終肌苷產(chǎn)量的差異超過8 g/L，這也足以說明合適的蛋白胨對菌種發(fā)酵有著明顯的正向效果。蛋白胨是一種由月示、胨、肽和氨基酸等組成的混合物，在胞內(nèi)水解后才會發(fā)揮作用，水解程度不同，得到的產(chǎn)物對細(xì)胞的作用也會不同。劉定杭等[12]經(jīng)酶法對牛骨蛋白胨進(jìn)行了不同程度的水解，得到11種蛋白胨，選擇副干酪乳桿菌和產(chǎn)低溫蛋白酶兩種菌株作為測試菌株，對11種蛋白胨的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌對蛋白胨的水解程度沒有明顯要求，11種蛋白胨均可以滿足細(xì)胞生長需求，但是產(chǎn)低溫蛋白酶菌株所產(chǎn)出蛋白質(zhì)的活力與蛋白胨中小分子肽所占比例有關(guān)，比例越高，產(chǎn)低溫蛋白酶菌株產(chǎn)出的目的蛋白活性越高，表明一些目的產(chǎn)品會受到蛋白胨中多肽分布及分子量大小的影響。

微生物發(fā)酵過程中，酵母浸粉和蛋白胨已被視為必需營養(yǎng)物質(zhì)，為達(dá)到最佳發(fā)酵效果，兩者總是會搭配使用。酵母浸粉蛋白分子與蛋白胨分子相比較小，水解物分子量介于月示和肽之間，小分子的酵母浸粉有利于菌體吸收，促進(jìn)菌體生長，蛋白胨的使用則利于產(chǎn)物穩(wěn)定期的延長，促進(jìn)產(chǎn)物代謝，大分子蛋白質(zhì)有利于刺激蛋白的表達(dá)，促進(jìn)產(chǎn)物代謝。在以大腸桿菌生產(chǎn)多種氨基酸時[13-17]，培養(yǎng)基中酵母浸粉和蛋白胨都被視為必需成分來添加，以滿足細(xì)胞生長的需求。

微生物發(fā)酵行業(yè)中利用的玉米漿僅占玉米漿生產(chǎn)總量的很少一部分，玉米漿生產(chǎn)成本低，因此擴(kuò)大玉米漿在微生物發(fā)酵行業(yè)中的應(yīng)用不僅可以提高玉米漿價值，也可以降低微生物發(fā)酵生產(chǎn)成本。但是，玉米漿成分的不穩(wěn)定性是我們在利用玉米漿時必須面對的問題。生產(chǎn)原料工藝控制、生產(chǎn)季節(jié)及玉米漿的儲運等因素均會造成玉米漿成分的改變，對微生物發(fā)酵產(chǎn)生較為明顯的影響[18]。乳酸菌的培養(yǎng)成分復(fù)雜，需添加營養(yǎng)物質(zhì)豐富的酵母浸粉和牛肉膏，但酵母浸粉和牛肉膏生產(chǎn)成本較高，增加了乳酸發(fā)酵的成本。丁涓等[19]嘗試用玉米漿替代乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基中的牛肉膏，以期降低生產(chǎn)成本。研究表明：質(zhì)量濃度為41 g/L玉米漿為主要氮源時，L-乳酸產(chǎn)量為11 g/L，相同條件下與添加牛肉膏9.02 g/L時產(chǎn)酸量接近，大大降低了成本，提高了生產(chǎn)效率。韓洪軍等[20]利用易于培養(yǎng)的大腸桿菌發(fā)酵積累乳酸，同時將無機(jī)鹽培養(yǎng)基替換為以玉米漿為有機(jī)氮源、葡萄糖結(jié)晶廢糖液為碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，最終乳酸為112 g/L左右。此外，玉米漿中含有少量磷，磷是細(xì)胞膜磷脂雙分子層的基礎(chǔ)，也是蛋白質(zhì)和核酸的組成部分[18]。在多種氨基酸如谷氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸和絲氨酸等[21-23]發(fā)酵生產(chǎn)中，玉米漿被視為常用的有機(jī)氮源添加入培養(yǎng)基中。

3 其他有機(jī)氮源及其應(yīng)用

除上述有機(jī)氮源，豆粕水解液、花生餅粉和黃豆餅粉等有機(jī)氮源在特定微生物發(fā)酵生產(chǎn)中也得到利用。在溫敏型谷氨酸發(fā)酵工藝中，豆粕水解液作為常用有機(jī)氮源來滿足發(fā)酵所需的各種氨基酸及微生素，在纈氨酸、乳酸和肌苷等發(fā)酵條件下優(yōu)化有機(jī)氮源時，研究者也將豆粕水解液視為一種可選的氮源進(jìn)行了研究，豆粕水可以提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)且縮短發(fā)酵周期[24-25]。但是豆粕水解液價格較高，增加了谷氨酸的生產(chǎn)成本，現(xiàn)已有人研究如何利用玉米漿替換豆粕水解液，以降低生產(chǎn)成本。

花生餅粉為純白無味的物質(zhì)，添加入食品中可以提高食品的營養(yǎng)價值，還可以保持食品的原有風(fēng)味，已被直接用于飼料及食品涂料。在利用微生物生產(chǎn)α-淀粉酶時，花生餅粉被視為最佳有機(jī)氮源，無論是利用枯草芽孢桿菌[26]還是米曲霉[27]生產(chǎn)α-淀粉酶，以花生餅粉為氮源得到的淀粉酶的活力最高。在培養(yǎng)一些真菌時，培養(yǎng)基中添加黃豆餅粉則有利于孢子的產(chǎn)生，紅谷霉素[28]、抗生素AGPM[29]和靈芝菌絲體[30]發(fā)酵過程中，黃豆餅粉的添加均有利于目的產(chǎn)物的積累。

黃豆餅粉、棉籽、大豆?jié)饪s蛋白和蠶蛹粉作為有機(jī)氮源供體，也應(yīng)用于不同的領(lǐng)域，見表1。

表1 各種有機(jī)氮源的應(yīng)用Table 1 Application of various organic nitrogen sources

4 結(jié) 論

隨著有機(jī)氮源的發(fā)展應(yīng)用，復(fù)合氮源[31]一詞也應(yīng)運而生，即在微生物培養(yǎng)過程中，人們并不是僅使用單一有機(jī)氮源，無機(jī)氮源與其他有機(jī)氮源也共同發(fā)揮作用。多種氮源按一定比例同時添加入培養(yǎng)基中，能更好地保證微生物的順利生長及目的產(chǎn)物的積累。但是復(fù)合氮源的添加配比也需要在實驗中摸索，以得到最佳配比。選擇有機(jī)氮源時，需要考慮每種氮源和所用微生物的特性，選擇合適的氮源，避免因營養(yǎng)源缺乏造成微生物生長受限和有機(jī)氮源的浪費。與動物和植物有機(jī)氮源相比，面包酵母類氮源經(jīng)純培養(yǎng)而來，含有的蛋白穩(wěn)定性更高。酵母類和一些植物類有機(jī)氮源，生長因子較為豐富。有些有機(jī)氮源，比如豆粕水解液，生產(chǎn)中要經(jīng)過高溫、酸解等過程，使得大量生長因子流失。玉米漿和酵母類有機(jī)氮源含量較高，牛骨蛋白胨和胰蛋白胨等含量較低。 有機(jī)氮源與微生物發(fā)酵有著密不可分的聯(lián)系，深入研究有機(jī)氮源的組分及其對微生物發(fā)酵的作用機(jī)制，對以后理性使用有機(jī)氮源有著深遠(yuǎn)意義。