井岡霉素發(fā)酵過(guò)程溶氧濃度的優(yōu)化控制

(浙江省桐廬匯豐生物科技有限公司，浙江 桐廬 311500)

井岡霉素是以井岡霉素A，B，C，D，E，F(xiàn)，G等組分為主，含有多種糖類、鹽類等雜質(zhì)的混合物，具有強(qiáng)吸濕性，溶水呈弱堿性，常溫下在弱酸至弱堿的范圍內(nèi)穩(wěn)定，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或超過(guò)135 ℃的高溫下易分解，不溶于苯、乙醚、氯仿，甚至難溶于丙酮、乙醇和石油醚。井岡霉素主要用于防治水稻紋枯病，以及易患紋枯病的小麥與玉米、患立枯病或根腐病的蔬菜和患立枯病的豆類與棉花等農(nóng)作物。井岡霉素可以被人、畜等腸內(nèi)細(xì)菌分解為無(wú)法被腸道吸收、可以全部排出體外的井岡胺與葡萄糖，故對(duì)動(dòng)物無(wú)毒害，是一種綠色環(huán)保的農(nóng)用抗生素，具有高效、低殘留和綠色等優(yōu)點(diǎn)[1]。

目前，在井岡霉素的生產(chǎn)中，發(fā)酵水平的提高是其生產(chǎn)的瓶頸[2-3]。井岡霉素如今受到己唑醇、戊唑醇和氟環(huán)唑等化學(xué)農(nóng)藥的沖擊，市場(chǎng)份額不斷受到擠壓。要提高井岡霉素的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，需要進(jìn)一步提高其發(fā)酵水平[4]來(lái)降低生產(chǎn)成本。在需氧發(fā)酵過(guò)程中，溶氧(DissoIved Oxygen，DO)是影響發(fā)酵的重要因素之一，溶氧條件不僅影響菌體生成，對(duì)產(chǎn)物積累的影響也很大。因此，優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程中的溶氧控制策略，對(duì)發(fā)酵具有重要意義[5-12]。發(fā)酵后期，隨著菌絲逐漸衰亡，對(duì)DO的需求相應(yīng)減少，DO會(huì)逐漸升高，針對(duì)這一現(xiàn)象，筆者對(duì)井岡霉素發(fā)酵后期DO對(duì)井岡霉素效價(jià)的影響進(jìn)行了研究；還通過(guò)分階段控制通氣量，降低壓縮空氣的使用量，對(duì)通氣量對(duì)井岡霉素效價(jià)的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

吸水鏈霉菌井岡變種(Streptomyceshygroscopicusvat. Validamycin)，菌株編號(hào)1228，由桐廬匯豐生物科技有限公司種子室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：大米40 g/L，花生餅10 g/L，蠶蛹粉10 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 2 g·L-1，CaCO32 g/L，KH2PO40.625 g/L，pH 7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大米110 g/L，花生餅粉20 g/L，NaCl 1.45 g/L，CaCO30.625 g/L，KH2PO40.95 g/L，pH 7.5。

1.1.3 培養(yǎng)條件

斜面種子培養(yǎng)條件：瓊脂茄子瓶斜面，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)116 h。

二級(jí)種子培養(yǎng)條件：種子罐容積為500 L，培養(yǎng)溫度為38 ℃，罐壓為0.05 MPa，每分鐘通氣量與罐內(nèi)料液的體積比為0.5，接種量約1茄瓶。

5 000 L罐/50 000 L罐發(fā)酵條件：采用二級(jí)發(fā)酵，發(fā)酵罐容積為5 000 L，培養(yǎng)溫度為40 ℃，罐壓為0.05 MPa，每分鐘通氣量與罐內(nèi)料液的體積比為0.5，移種量與罐內(nèi)發(fā)酵液的體積比為1∶10。

1.2 測(cè)定方法

用HCl(ω=25%)將發(fā)酵液調(diào)至pH為3.0，加熱到80 ℃，4 000 r/min離心5 min，過(guò)濾。采用液相色譜法測(cè)定井岡霉素效價(jià)，重復(fù)3次。色譜條件為

色譜柱：L=200 mm，φ=4.6 mm(ODS-C18不銹鋼柱)，5 μm；T=40 ℃。

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器(210 nm)。

流動(dòng)相：c(Na2HPO4)=0.005 mol/L與φ(CH3OH)=5%的體積配比為97∶3。

流速：1.2 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵中后期5 000 L罐自控轉(zhuǎn)速維持DO在最大飽和量的50%對(duì)效價(jià)的影響

對(duì)發(fā)酵中后期攪拌轉(zhuǎn)速采用(比例—積分—微分)控制器控制，維持DO在最大飽和量的50%，從表1中可以看出：采用PID控制攪拌轉(zhuǎn)速的效價(jià)比不控制要高，說(shuō)明自控轉(zhuǎn)速維持DO在最大飽和量的50%對(duì)效價(jià)無(wú)影響。

表1發(fā)酵中后期5000L罐自控轉(zhuǎn)速維持DO在最大飽和量的50%對(duì)效價(jià)的影響

Table1EffectofautomaticcontrolspeedonDOinthemidandlaterphaseoffermentor

類別效價(jià)/(μg·mL-1)試驗(yàn)1試驗(yàn)2試驗(yàn)3平均值±標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)照(不控制)19 96320 45419 45319 956.67±408.68試驗(yàn)(PID控制)20 06720 07319 82219 987.33±116.93

發(fā)酵中后期5 000 L罐PID控制轉(zhuǎn)速維持DO對(duì)效價(jià)的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵中后期5 000 L罐PID控制轉(zhuǎn)速維持DO對(duì)效價(jià)的影響 Fig.1 Effect of automatic control speed on DO in the mid and later phase of fermentor

發(fā)酵中后期PID控制轉(zhuǎn)速對(duì)5 000 L罐D(zhuǎn)O的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵中后期PID控制轉(zhuǎn)速對(duì)5 000 L罐D(zhuǎn)O的影響Fig.2 Effect of automatic control speed on DO in the mid and later phase of fermentor

2.2 發(fā)酵中后期5 000 L罐人工控制攪拌轉(zhuǎn)速維持DO在最大飽和量的50%對(duì)效價(jià)的影響

發(fā)酵中后期對(duì)5 000 L罐采用人工控制攪拌轉(zhuǎn)速維持DO在最大飽和量的50%，結(jié)果見表2，可以看出：人工控制通氣量的效價(jià)比不控制低，說(shuō)明人工控制攪拌轉(zhuǎn)速維持DO在最大飽和量的50%對(duì)效價(jià)無(wú)影響。

表2發(fā)酵中后期5000L罐手控制攪拌轉(zhuǎn)速維持DO在最大飽和量的50%對(duì)效價(jià)的影響

Table2EffectofmanualcontrolspeedonDOinthemidandlaterphaseoffermentor

類別效價(jià)/(μg·mL-1)試驗(yàn)1試驗(yàn)2試驗(yàn)3平均值±標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)照(不控制)20 38921 06019 98320 477.33±444.10試驗(yàn)(人工控制)20 23821 45320 72920 806.67±499.05

發(fā)酵中后期5 000 L罐人工控制攪拌轉(zhuǎn)速維持OD對(duì)效價(jià)的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵中后期5 000 L罐人工控制攪拌轉(zhuǎn)速維持DO對(duì)效價(jià)的影響Fig.3 Effect of manual control speed on DO in the mid and later phase of fermentor

發(fā)酵中后期控制通氣量對(duì)5 000 L罐在線DO的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵中后期控制通氣量對(duì)5 000 L罐在線DO的影響Fig.4 Effect of manual control speed on DO in the mid and later phase of fermentor

2.3 發(fā)酵中后期階段控制5 000 L罐通氣量對(duì)效價(jià)的影響

根據(jù)2.1與2.2的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)現(xiàn)行生產(chǎn)工藝中的通氣量中后期進(jìn)行調(diào)整，分階段將每分鐘通氣量與罐內(nèi)料液體積比從0.5逐漸降至0.35，最后至0.15。從表3得出：井岡霉素效價(jià)隨發(fā)酵中后期階段對(duì)通氣量的控制略有降低，但影響幅度小。綜合產(chǎn)品與電氣成本因素考慮，發(fā)酵中后期階段控制通氣量對(duì)5 000 L罐井岡霉素效價(jià)的影響微小。

表3發(fā)酵中后期階段控制5000L罐通氣量對(duì)效價(jià)的影響

Table3Effectofstagecontrolventilationon5000Linthemidandlaterphaseoffermentor

類別效價(jià)/(μg·mL-1)試驗(yàn)1試驗(yàn)2試驗(yàn)3平均值±標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)照(不控制)19 44618 96819 96119 458.33±405.48試驗(yàn)(控制)19 10519 15519 37019 210.00±114.96

發(fā)酵中后期階段控制通氣量對(duì)井岡霉素效價(jià)的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵中后期階段控制通氣量對(duì)井岡霉素效價(jià)的影響Fig.5 Effect of stage control ventilation on 5 000 L in the mid and later phase of fermentor

發(fā)酵中后期階段控制通氣量對(duì)5 000 L罐在線DO的影響見圖6。

圖6 發(fā)酵中后期階段控制通氣量對(duì)5 000 L罐在線DO的影響Fig.6 Effect of stage control ventilation on DO in the mid and later phase of fermentor

每分鐘通氣量與罐內(nèi)料液體積的比值：30 h為0.50 m3/L,40 h為0.35 m3/L,45 h為0.15 m3/L。

2.4 發(fā)酵中后期50 000 L罐階段控制通氣量對(duì)效價(jià)的影響

根據(jù)2.3的試驗(yàn)結(jié)果，放大至50 000 L罐試驗(yàn)。表4說(shuō)明50 000 L罐隨階段通氣量的控制對(duì)效價(jià)的影響幅度不大?？紤]經(jīng)濟(jì)性，發(fā)酵中后期階段控制通氣量對(duì)50 000 L罐井岡霉素效價(jià)的對(duì)生產(chǎn)水平影響不明顯，且可降低生產(chǎn)成本。

表4發(fā)酵中后期50000L罐階段控制通氣量對(duì)效價(jià)的影響

Table4Effectofstagecontrolventilationon50000Linthemidandlaterphaseoffermentor

類別效價(jià)/(μg·mL-1)試驗(yàn)1試驗(yàn)2試驗(yàn)3平均值±標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)照(不控制)19 20518 78018 26118 748.67±386.02試驗(yàn)(控制)19 29918 58018 06118 646.67±507.61

發(fā)酵中后期50 000 L罐階段控制通氣量對(duì)效價(jià)的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵中后期50 000 L罐階段控制通氣量對(duì)效價(jià)的影響Fig.7 Effect of stage control ventilation on 50 000 L in the mid and later phase of fermentor

發(fā)酵中后期階段控制通氣量對(duì)培養(yǎng)中代謝及效價(jià)的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵中后期階段控制通氣量對(duì)培養(yǎng)中代謝及效價(jià)的影響Fig.8 Effect of stage control ventilation on metabolism in the mid and later phase of fermentor

3 結(jié) 論

在發(fā)酵培養(yǎng)的中后期，隨著井岡霉素菌絲逐漸衰亡，對(duì)DO的需求相應(yīng)減少，DO會(huì)逐漸升高。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在中后期通過(guò)降低攪拌速度或減少通氣量來(lái)使DO維持在一定的空氣飽和度，對(duì)井岡霉素的生產(chǎn)沒(méi)有影響。為簡(jiǎn)化實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中的工藝控制，在50 000 L罐上采用分階段控制通氣量，對(duì)效價(jià)影響幅度僅有-0.54%。試驗(yàn)表明可較大減少壓縮空氣的使用量，對(duì)降低生產(chǎn)成本具有重要的指導(dǎo)意義。