HLC-723G8 全自動HbA1 c分析儀測定的影響因素及對策

周冰 張如平

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，貴州 貴陽 550003)

血紅蛋白A是由4個亞鐵血紅素和2對α和 β珠蛋白鏈構(gòu)成的四聚體。而血紅蛋白A1 c則是血紅蛋白A的 β鏈末端氨基酸殘基與葡萄糖結(jié)合而成的HbA1 c。HbA1 c是由分兩個階段的非酶糖化反應(yīng)所生成。第一步由葡萄糖和血紅蛋白結(jié)合形成可逆的醛亞胺中間產(chǎn)物(不穩(wěn)定型A1 c)，而后經(jīng)過較長時間的不可逆反應(yīng)形成穩(wěn)定的基酮氨(穩(wěn)定性A1 c)，這個最終產(chǎn)物也就是現(xiàn)在通常所檢測的HbA1 c。我科于2017年購買一臺HLC-723G8全自動糖化血紅蛋白(HbA1 c)分析儀，通過一年多的臨床應(yīng)用，在這里我們對HbA1 c檢測結(jié)果構(gòu)成的影響相關(guān)因素進行探討。

1 影響因素

1.1 檢驗方法 HbA1 c測定方法的原理有多種：(1)根據(jù)HbA1 c與Hb的電荷差異，如離子交換層析法、高效液相層析法(HPLC)、電泳和等電聚焦電泳法;(2)根據(jù)Hb上糖化集團結(jié)構(gòu)差異，如親和層析、免疫測定法、離子捕獲法和酶法; (3)化學(xué)分析，分光光度法、比色法。

高效液相層析法(HPLC)是在全血狀態(tài)下測試，酶法或免疫法則是將血液離心后從紅細胞層進行采樣。測定方法不同對HbA1 c的檢測結(jié)果所產(chǎn)生的干擾也不同。

1.2 不穩(wěn)定產(chǎn)物對檢測的影響 L-A1c是HbA1 c在進行初期反應(yīng)時所產(chǎn)生的一種產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)不是十分穩(wěn)定，會隨血糖濃度的變化而變化，可水解為葡萄糖和Hb，也可生成更穩(wěn)定的醛胺。該物質(zhì)不能對平均血糖的濃度進行反映，但可對HbA1 c的測定結(jié)果產(chǎn)生影響[1]。硼酸鹽親和色譜法和免疫法不對L-A1c進行檢測，所以不會受其影響[2]。離子交換色譜法和電泳法受該物質(zhì)的影響相對較大，有研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)可使離子交換色譜法測定得到的HbA1 c值比實際值高出1.5%左右[3]。最簡單去除該物質(zhì)的方法是將樣本用溶血劑進行處理，將溶血產(chǎn)物在37 ℃水浴箱中孵育6 h左右[4]。

1.3 Hb變異體對檢測的影響 HbF不會對離子交換色譜法和親和色譜法的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，而免疫法易受到HbF的干擾。研究發(fā)現(xiàn)即使HbF濃度在15%以上，Bio-Rad VariantⅡ和Tosoh G7兩種離子交換層析柱也不會受到太大的影響[5]。但CLC330/385親和層析柱法的測定結(jié)果會比實際值低，尤其當(dāng)HbF在20%以上時，測得的HbA1 c值會下降1%左右，甚至更多。該物質(zhì)對CLC330/385親和色譜法所產(chǎn)生的干擾比較多，可能是由于HbF的糖化速率相對較慢。HbF可以使DCA-2000免疫法的測定值較實際值低，因為在HbF分子中HbA的β鏈被γ鏈所取代[6]。

1.4 常見的化學(xué)衍生物對檢測結(jié)果的影響 氨基甲酰Hb在患有尿毒癥的患者血液中的濃度會明顯升高，是最常見的對HbA1 c檢測結(jié)果造成干擾的化學(xué)衍生物[7]。尿素在患者體內(nèi)可自發(fā)形成氨和氰酸鹽化合物，氰酸鹽經(jīng)過質(zhì)子化作用后可以形成異氰酸，該產(chǎn)物與蛋白質(zhì)的α和ε氨基基團反應(yīng)可以形成氨基甲酰。Hb的β鏈的N端上的纈氨酸與異氰酸發(fā)生結(jié)合反應(yīng)形成氨基甲酰Hb[8]。該物質(zhì)與HbA1 c的等電點比較相似，故可對依據(jù)電荷原理對HbA1 c的水平進行測定的方法形成一定的干擾。電泳法對氨基甲酰Hb的反應(yīng)非常敏感。在患者的體內(nèi)，氨基甲酰化的Hb的濃度如果在5.4%以上時，就會導(dǎo)致采用離子交換法測定得到的HbA1 c值比真實偏高[9]。

1.5 影響紅細胞生存時間的因素對檢測結(jié)果的干擾 HbA1 c在患者的紅細胞內(nèi)的合成進程是連續(xù)進行的， 但是速度一般情況下比較緩慢，任何一種能夠?qū)е聶C體內(nèi)的紅細胞壽命明顯縮短的疾病都會使HbA1 c形成的時間顯著縮短，使得檢測所得到的最終結(jié)果受到一定程度的影響。由于某些基礎(chǔ)性疾病多導(dǎo)致的繼發(fā)性溶血現(xiàn)象，往往會導(dǎo)致該項檢測所得到的最終結(jié)果明顯偏低，例如患有肝硬化、脾腫大等疾病的患者。此外采用EPO(促紅細胞生成素)進行治療及處于極度貧血狀態(tài)下的患者采用輸血的方法進行治療，也會對HbA1 c的檢測結(jié)果造成很大的影響[10]。

1.6 藥物的影響 維生素E可對Hb的糖基化產(chǎn)生十分明顯的抑制效果，使測定所得到的最終結(jié)果出現(xiàn)假性降低現(xiàn)象。相關(guān)研究結(jié)果顯示，患有缺鐵性貧血的患者在血糖的濃度相對恒定、紅細胞數(shù)顯著減少的情況下，HbA1 c的測定值會顯著升高，用鐵劑(100 mg/d)對該類患者治療3個月之后，由于幼紅細胞的出現(xiàn)使得Hb的濃度顯著降低，可以使HbA1 c平均值由7.0%下降至6.0%左右[11]，使測定所得到的最終結(jié)果出現(xiàn)假性降低現(xiàn)象。利巴韋林引起的溶血，使紅細胞壽命縮短導(dǎo)致HbA1 c結(jié)果降低。血透病人的HbA1 c會下降，(但是用含葡萄糖的透析液作血透的腎衰病人會增高)。 采用EPO(促紅細胞生成素)進行治療時， 大量的紅細胞增生，蛋白總量快速增加，而HbA1 c仍然以緩慢的速度生成，其與Hb總面積的百分比就相對偏低，導(dǎo)致HbA1 c結(jié)果偏低。

1.7 貯存溫度對檢測結(jié)果的影響 HbA1 c穩(wěn)定性好，標(biāo)本即使在室溫下放置3～14 h也不會明顯影響測定結(jié)果。潘月等[12]對不同溫度條件下儲存的全血標(biāo)本進行了檢測，全血標(biāo)本4～8℃保存第7天時，所測得結(jié)果顯著低于新鮮標(biāo)本。在-20 ℃下儲存第28天時，所測得結(jié)果也顯著低于新鮮標(biāo)本。因此，若全血標(biāo)本不能及時測定，需將其放置4～8 ℃保存，并最好在15 h內(nèi)進行測定，此時HbA1 c檢測結(jié)果變異率<3%。在室溫的條件下，樣本的穩(wěn)定性相對較差。

1.8 標(biāo)本的質(zhì)量 在HLC-723G8全自動HbA1 c分析儀的檢測結(jié)果中有Total Area的信息，這是與注入層析柱的血液樣本中總血紅蛋白成比例的數(shù)值。Total Area應(yīng)保持在適當(dāng)?shù)姆秶?。如果注入的血液過于稀薄，Total Area過低會導(dǎo)致HbA1 c檢測結(jié)果偏低。反之，如果血液過于濃稠，Total Area過高則會導(dǎo)致HbA1 c檢測結(jié)果偏高，而通常在這種情況下，檢測結(jié)果的增高可能會達0.5%～1%，甚至?xí)?dǎo)致層析柱的損傷。

1.9 抗凝劑乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)的影響 抗凝管測定HbA1c作為標(biāo)準(zhǔn)用管。抽血量1～3 mL，混勻，無凝塊，抗凝管無破損。有報道使用肝素抗凝，結(jié)果會偏高。

1.10 某些疾病的影響 例如肝硬化：肝臟能使血糖濃度保持恒定，當(dāng)餐后血糖濃度升高(>8.25 mmol/L)時，肝細胞迅速攝取葡萄糖并將其合成肝糖原貯存起來，當(dāng)空腹時糖濃度降低至(<3.9 mmol/L)，肝糖原迅速分解生成葡萄糖補充血糖，還能進行糖異生參與血糖的調(diào)節(jié)， 肝硬化病人的血糖調(diào)節(jié)功能下降，常常會出現(xiàn)低血糖，從而導(dǎo)致HbA1 c生成偏低。

1.11 其他影響因素 年齡、種族、性別、空腹血糖、餐后2 h血糖等均是HbA1c測定準(zhǔn)確性的獨立影響因素。HbA1c與空腹血糖呈正相關(guān)，而空腹血糖水平隨年齡增長有所增高，HbA1c檢測結(jié)果也隨之發(fā)生變化[13]。一般認為年齡與HbA1c值無關(guān)，但Pani[14]等對2473名正常人和3270 名血糖調(diào)節(jié)受損者進行HbA1c測定，在調(diào)查性別、體質(zhì)量指數(shù)、空腹血糖、餐后2 h血糖等因素后，認為年齡每增加1 歲，HbA1c測定值升高0.03%。不同種族的HbA1c值不同， Herman[15]等對3819名血糖調(diào)節(jié)受損者測定， HbA1c 在調(diào)整年齡、性別、教育、婚姻、血壓等多項影響因素后，美國白種人、西班牙裔人、亞洲裔人、印第安人的HbA1c平均值分別為5.78% 、5.93% 、6.00%、6.18%， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 對 策

2.1 了解儀器的性能，減少誤差出現(xiàn) HbA1c測定方法不少，不同方法，原理不同，其影響因素也不相同。檢驗工作人員應(yīng)了解檢測方法對于各種變異體檢測的局限性以及引起HbA1c假性升高或降低的因素，并在報告中為醫(yī)生作出提示。我院購進的HLC-723G8全自動HbA1c測定儀，其原理為高效液相層析法(HPLC)。測定HbA1c的百分含量，目前認為是分析HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)。要注意因血紅蛋白變異體引起的誤差。若遇到高度可疑地中海貧血和血紅蛋白病的病人，在發(fā)出報告前須仔細檢查色譜圖確認可能存在的血紅蛋白變異體，一旦發(fā)現(xiàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，可以采用變異模式，分離諸如HbS，HbC 等在HbAO峰后析出的變異血紅蛋白，通過其峰面積的補正而獲得更為準(zhǔn)確的HbA1c檢測結(jié)果。另外，仔細閱讀廠商提供的使用說明書可避免發(fā)出一些不準(zhǔn)確的結(jié)果。認真檢查有無異常色譜圖，提高操作儀器的技能和具備判斷圖譜的能力。

2.2 備注性檢驗報告 關(guān)注HbA1c的極度異常值以及HbA1c與血糖不一致的結(jié)果。如：對于某些血紅蛋白異常偏低，疑似貧血患者，可以通過備注系統(tǒng)提示臨床“該份標(biāo)本檢測貧血，影響HbA1c檢測結(jié)果”。而對于血糖結(jié)果與HbA1c結(jié)果存在差異的樣本，同樣可以通過備注系統(tǒng)及時提醒臨床進行復(fù)查。受檢測儀器本身原理的影響，可能會受到異常血紅蛋白的干擾而異常增高或顯著偏低，對于此類樣本，也應(yīng)給出更為詳盡的備注，內(nèi)容包括提示存在異常血紅蛋白干擾，建議用免疫法檢測HbA1c，檢測血紅蛋白電泳等等。

因此，美國臨床生化學(xué)會(NACB)要求當(dāng)HbA1 c>15%或低于參考區(qū)間下限時應(yīng)重復(fù)測定一次(最好用不同原理的方法)，以確定是否有血紅蛋白變異體的存在[16]。

2.3 合理解釋特定病人的HbA1 c檢測結(jié)果 應(yīng)清楚認識到某些藥物和某些疾病會造成HbA1 c假性升高或降低。其中部分藥物在臨床上使用十分廣泛，如服用水楊酸鹽、維生素C、阿片類藥物可引起假性升高。維生素E、病毒唑、α-干擾素可引起假性降低。某些疾病如：嚴(yán)重的高甘油三酯血癥，嚴(yán)重的高膽紅素血癥、尿毒癥、缺鐵性貧血、鉛中毒、長期飲酒均可引起假性升高。慢性腎病、肝硬化、妊娠初期可引起假性降低。當(dāng)用HbA1c評估鐵、維生素B12或葉酸缺乏引起的貧血的糖尿病病人的血糖控制情況時，應(yīng)充分考慮HbA1 c結(jié)果可能存在假性升高，不能真實反映病人的平均血糖水平。在做出任何醫(yī)療改變前應(yīng)要求病人在餐前和餐后2h連續(xù)檢測毛細血管血糖水平數(shù)天，評估血糖自我監(jiān)測結(jié)果是否與期望的HbA1 c水平一致，以避免潛在的不適當(dāng)?shù)闹委熀徒档偷吞茄Y的風(fēng)險。

2.4 替代指標(biāo)的選擇 在HbA1c不能準(zhǔn)確反映血糖控制的情況下，使用替代指標(biāo)是合適的選擇。這些指標(biāo)包括果糖胺、糖化白蛋白、1，5-脫水葡糖醇(1，5-AG)和連續(xù)葡萄糖監(jiān)測(continuous glucose monitoring，CGM)。盡管果糖胺、糖化白蛋白、1，5-AG和CGM檢測與平均血糖水平相關(guān)，重要的是要記住只有HbA1c是通過驗證證明可作為評價長期血糖控制和并發(fā)癥形成風(fēng)險的測量指標(biāo)，因此HbA1c仍是測量血糖控制狀況的金標(biāo)準(zhǔn)，這些替代方法只能用于HbA1c結(jié)果不準(zhǔn)確或誤導(dǎo)的情況，或?qū)bA1c進行補充[17]。

2.5 儀器的維護 常規(guī)的日常維護包括過濾器、層析柱的使用、更換，定期適時的校準(zhǔn)。

3 小 結(jié)

HbA1 c是指示血糖控制情況的金標(biāo)準(zhǔn)，同時也是貫穿糖尿病診治過程中極為重要的管理基石。由于諸多因素均可以造成HbA1 c檢測值的假性升高或降低，因而開展HbA1 c檢測標(biāo)準(zhǔn)化工作極為重要。注重HbA1 c的檢測質(zhì)量，進一步關(guān)注細節(jié)，重視檢測的所有過程，充分滿足分析中各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求，更多貫穿落實HbA1 c的標(biāo)準(zhǔn)化，確保為臨床提供更為準(zhǔn)確、有效的檢測結(jié)果。