LIN28/let-7與腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展

柴洋 綜述 謝明祥 審校

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 遵義 563003)

目前認(rèn)為L(zhǎng)IN28/let-7信號(hào)通路[1]在胚胎發(fā)育、炎癥和代謝中的調(diào)控[2]與惡性腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展機(jī)制密切相關(guān)[3]。LIN 28適度表達(dá)與Oct 4、Sox 2和Nanog共同將人體成纖維細(xì)胞重組成多能干細(xì)胞，而LIN28過(guò)度表達(dá)則誘導(dǎo)細(xì)胞惡性變[4]。LIN28已被證明在let-7轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中通過(guò)抑制let-7而致癌。據(jù)報(bào)道，LIN28在一些預(yù)后較差的腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、惡性生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢癌、B細(xì)胞淋巴瘤、肺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。并且與血清甲胎蛋白(AFP)水平升高、高級(jí)別肝癌發(fā)生以及結(jié)腸癌整體生存率降低、腫瘤復(fù)發(fā)可能性增加相關(guān)。 因此，深入研究LIN28/let-7通路的調(diào)控機(jī)制將為惡性腫瘤的診斷和治療提供新的策略。

1 LIN28與let-7的基本結(jié)構(gòu)及功能

1.1LIN28 LIN28最早在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)，其控制線蟲時(shí)間和空間發(fā)育的多樣性，突變將導(dǎo)致幼蟲發(fā)育時(shí)間的紊亂[5]。LIN28廣泛表達(dá)于胚胎干細(xì)胞，伴隨RNA調(diào)控代謝過(guò)程[6]的RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)，介導(dǎo)RNA的成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和翻譯，可能存在多種RNA靶標(biāo)，其表達(dá)缺陷會(huì)導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。LIN28含有兩個(gè)結(jié)合RNA的結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在動(dòng)物中都是高度保守的。一個(gè)是氨基末端的冷休克結(jié)構(gòu)域(CSD)，另一個(gè)是羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)域(ZKD)[7-8]。ZKD由兩個(gè)串聯(lián)的 CCHC(Cys-Cys-His-Cys)組成，即CCHC×2。LIN28依賴CSD和ZKD抑制miRNA家族let-7成熟來(lái)執(zhí)行在干細(xì)胞功能、糖代謝、組織再生和腫瘤發(fā)生中的重要作用。LIN28有兩種小于30 kDa的同源易構(gòu)體：LIN28A和LIN28B，雖然分子結(jié)構(gòu)不同，但具有相似的表達(dá)水平和功能，通過(guò)抑制let-7促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[9]。

1.2let-7 let-7是長(zhǎng)度約20～23個(gè)nt(核苷酸)的非編碼RMA(微小RNA，microRNA，miRNA，miR)，同樣最先被發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲中。調(diào)控未分化細(xì)胞向分化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[10]。let-7家族的靶mRNA主要是癌基因，其在轉(zhuǎn)錄后水平與LIN28的mRNA特異性序列3’-UTR(3′非翻譯區(qū))結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA剪切或阻遏其翻譯，因而let-7行使著"抑癌基因"的功能。成熟let-7的家族成員有10個(gè)[11]，均由前體合成而來(lái)。首先，在細(xì)胞核中，let-7復(fù)制后經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ作用轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)let-7(pri-let-7)；接著pri-let-7被酶—蛋白復(fù)合體RNase Ⅲ Drosha-DGCR8蛋白切割成前體let-7(pre-let-7)，pre-let-7是具有60～80個(gè)nt、3’-端有2個(gè)nt突出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；最后pre-let-7經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exporting-5：RanGTP轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)后，被RNase Ⅲ Dicer再次切割，最后生成成熟let-7。

2 LIN28/let-7引起腫瘤的作用機(jī)制

2.1LIN28抑制let-7成熟的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) LIN28與pre-let-7結(jié)合過(guò)程中氨基末端CSD和羧基末端ZKD相互配合，缺一不可。在由LIN28與pre-let-7的末端環(huán)區(qū)域(preE)形成的晶體結(jié)構(gòu)中，pre-let-7 preE的loop環(huán)繞LIN28的CSD，pre-let-7的3’-stem GGAG模體與LIN28的ZKD結(jié)合[12]。在脊椎動(dòng)物pre-let-7中存在高度保守的GGAG模體，這對(duì)于pre-let-7與LIN28的結(jié)合是非常重要的。GGAG發(fā)生突變可以解除LIN28阻斷pre-let-7的成熟，并使TUT4[非經(jīng)典的poly(A)聚合酶—末端轉(zhuǎn)移酶4，末端尿嘧啶轉(zhuǎn)移酶，terminal uridyly transderase]介導(dǎo)pre-let-7 oligo-尿苷化(寡核苷酸尿苷化)受損。LIN28 ZKD中的兩個(gè)CCHC直接與pre-let-7 GGAG模體結(jié)合，并在RNA骨架中形成特征性扭結(jié)，在這種扭結(jié)構(gòu)象中，LIN28的Y140非常關(guān)鍵，其位于A3G1之間，形成夾心狀，并且與H162互相作用，形成扭結(jié)構(gòu)象。pre-let-7的A3壓緊G1與其形成氫鍵，有助于形成扭結(jié)構(gòu)象。pre-let-7的G1和G4之間的氫鍵由ZKD的剛性部分氨基酸殘基的羰基和氨?；羌芙閷?dǎo)，并且G1和G4插在了第一個(gè)CCHC中酪氨酸與組氨酸和第二個(gè)CCHC中組氨酸與蛋氨酸形成的疏水口袋中。LIN28的ZKD和pre-let-7的GGAG模體對(duì)于RNA結(jié)合pre-let-7和pre-let-7 oligo-尿苷化是必需的。雖然LIN28的ZKD可以特異性結(jié)合pre-let-7 GGAG模體，但是單獨(dú)的ZKD不能與pre-let-7結(jié)合并阻斷其成熟，需要CSD的參與。CSD能夠影響LIN28與pre-let-7結(jié)合的親和力和特異性。preE的loop環(huán)繞CSD，形成領(lǐng)帶狀，并且與ZKD和3’-stem GGAG模體結(jié)合的區(qū)域交叉形成領(lǐng)結(jié)。CSD的廣泛特異性使LIN28能夠識(shí)別let-7家族成員的前體。CSD影響和重塑靶RNA內(nèi)部的二級(jí)結(jié)構(gòu)。LIN28的CSD能夠使pre-let-7雙鏈stem-loop發(fā)生部分解鏈，然后封閉Dicer切割位點(diǎn)。CSD誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)重塑對(duì)于LIN28 ZKD識(shí)別pre-let-7 GGAG模體可能很重要，其促進(jìn)ZKD與3’-GGAG模體的結(jié)合。

研究表明，Dis312(3’-5’核酸外切酶)能夠降解oligo-尿苷化的pre-let-7。Dis312是由一個(gè)核糖核酸酶Ⅱ結(jié)構(gòu)域、2個(gè)CSD和一個(gè)CSD樣S1結(jié)構(gòu)域組成，CSD 和S1結(jié)構(gòu)域?qū)τ贒is312結(jié)合并降解oligo-尿苷化的pre-let-7是非常重要的。

2.2LIN28抑制let-7成熟的機(jī)制及過(guò)程 LIN28阻斷l(xiāng)et-7成熟的機(jī)制都是通過(guò)與其pre-let-7結(jié)合而發(fā)揮作用的。當(dāng)LIN28不存在時(shí)，TUT4和TUT7(Zcchc6)催化pre-let-7的1個(gè)nt 3’-突出端發(fā)生尿苷化(單核苷酸尿苷化，mono-尿苷化，mono-uridylation)形成具有2個(gè)nt 的3’-突出端。此后，Dicer通過(guò)它的PAZ結(jié)構(gòu)閾識(shí)別2個(gè)nt的3’突出端切割pre-let-7形成成熟let-7。因此，在LIN28不存在的情況下，如果刪除TUTs就會(huì)導(dǎo)致let-7水平下降，干擾let-7的功能。當(dāng)LIN28存在時(shí)，TUT4和TUT7催化pre-let-7的2個(gè)nt的3’-突出端發(fā)生尿苷化(寡核苷酸尿苷化，oligo-尿苷化，oligo-uridylation)，Dicer就不能識(shí)別延長(zhǎng)的3’突出端(>2個(gè)nt的3’突出端)，從而不能對(duì)pre-let-7切割并形成成熟let-7。并且在引入3’-5’核酸外切酶Dis312后，oligo-尿苷化的pre-let-7被降解。因此，在LIN28存在的情況下，pre-let-7更容易發(fā)生oligo-尿苷化，當(dāng)與LIN28結(jié)合后，pre-let-7 preE的某些區(qū)域和雙鏈stem的一部分變得更容易被單鏈特異性核酸酶切割。如果LIN28 CSD具有U-rich結(jié)合位點(diǎn)的優(yōu)先性，那么CSD可以識(shí)別oligo(U)尾巴，此外，這可能通過(guò)打開(kāi)pre-let-7的雙鏈stem推動(dòng)Dir312降解oligo(U)-pre-let-7。

2.3LIN28抑制let-7成熟導(dǎo)致腫瘤形成的特點(diǎn) 到目前為止，發(fā)現(xiàn)與LIN28/let-7相關(guān)的環(huán)路有：(1)ER-Src[13]/NF-κB[14]]/LIN28B/let-7/IL-6通路[15-16]；(2)Wnt-β-catenin[17]/LIN28/let-7[18-20]通路；(3)myc/LIN28B/let-7/HMGA2通路[21-26]。腫瘤基因組圖譜(TCGA)[27]定義的三條與惡性腫瘤相關(guān)的主要途徑RTK/RAS/PI3K信號(hào)通路、p53以及Rb抑癌通路都與LIN28有關(guān)，如p53可能增加let-7表達(dá)從而抑制LIN28。參與這些通路的上游基因，包括ras、ARF和CDK 4[28]，都與LIN28有關(guān)，LIN28已被證明參與了這三條途徑中的每一條；此外，LIN 28是干細(xì)胞重編程因子，因此針對(duì)LIN 28的藥物也可以靶向作用于惡性腫瘤干細(xì)胞。

放療抵抗是惡性腫瘤的治療障礙。研究表明，干擾LIN28以及過(guò)表達(dá)let-7a能夠抑制放療抵抗，且對(duì)指導(dǎo)化療也有重要意義[29]。如let-7低表達(dá)的患者接受基于順鉑、紫杉醇的化療方案預(yù)后良好，高表達(dá)的患者對(duì)于相同的化療方案預(yù)后很差，然而單獨(dú)使用順鉑則預(yù)后良好?？沟蛲龅鞍譩cl-xL[30]是let-7的靶基因，并且其在耐藥株中的表達(dá)水平顯著增加，推測(cè)LIN28/let-7/bcl-xL通路參與腫瘤細(xì)胞的耐藥過(guò)程。

3 小 結(jié)

研究已經(jīng)表明，具有LIN 28高表達(dá)的惡性腫瘤患者存活率降低。在惡性腫瘤中LIN28高表達(dá)和let-7的抑制可以用作臨床實(shí)踐中惡性腫瘤的診斷標(biāo)記物。而降低細(xì)胞內(nèi)LIN28蛋白含量，或增加let-7的水平可逆轉(zhuǎn)這種惡性循環(huán)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。另外，LIN28/let-7參與了惡性腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路，使其成為癌癥治療的潛在靶點(diǎn)，可以作為克服患者目前各種治療抵抗的新策略。