外泌體在卵巢癌化療耐藥中的研究進(jìn)展

袁夢(mèng)琴，王艷清，鮮舒，張莉，楊冬詠，劉詩(shī)意，程艷香

卵巢癌是一種高侵襲性腫瘤，是全世界婦科惡性腫瘤死亡的主要原因。卵巢癌患者手術(shù)減滅和化療的最初臨床反應(yīng)通常較好，但約80%的晚期卵巢癌患者在12～24個(gè)月內(nèi)發(fā)生腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)，并且最終由于化療耐藥而導(dǎo)致死亡，5年總生存率僅約為30%[1]。因此，明確卵巢癌化療耐藥機(jī)制并進(jìn)行靶向干預(yù)，有望成為攻克卵巢癌耐藥這一難題的有效途徑。

外泌體（exosomes）具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在很多生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤生長(zhǎng)與遷移、組織損傷的修復(fù)等。外泌體可由多種不同類型的細(xì)胞分泌，包括免疫細(xì)胞、肥大細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞等，且普遍存在于包括血清、腹水、腦脊液等在內(nèi)的多種生物體液中[2]。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不同的組成成分和功能，因此可作為疾病診斷的生物標(biāo)記物[3]。許多研究表明，外泌體與多種癌癥中腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間耐藥性的傳遞過(guò)程密切相關(guān)，其中也包括卵巢癌[4]。現(xiàn)對(duì)外泌體的生理、病理學(xué)效應(yīng)及其在卵巢癌細(xì)胞化療耐藥方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的合成與組成

外泌體最初于1983年從綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中鑒定出來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，真核生物細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成小的管狀內(nèi)體，并逐漸發(fā)育球形晚期內(nèi)體，其特征是形成腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILV）。ILV通過(guò)局部膜內(nèi)陷芽生，隨機(jī)吞噬部分胞質(zhì)內(nèi)容物并將跨膜蛋白和外周蛋白結(jié)合到內(nèi)陷膜中，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袆?dòng)態(tài)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的多囊泡體（multi-vesicle bodys，MVBs），隨后當(dāng)MVBs與細(xì)胞膜融合，其內(nèi)的囊泡再次凹陷，以內(nèi)出芽方式形成顆粒狀小囊泡，并釋放入細(xì)胞外環(huán)境，即外泌體[5]。

外泌體含有許多不同的細(xì)胞表面分子，能夠同時(shí)與許多不同的細(xì)胞受體結(jié)合，從而參與細(xì)胞之間的物質(zhì)交換?，F(xiàn)有研究表明，外泌體內(nèi)成分非常復(fù)雜，有多種核酸[微小RNA（microRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）等]、蛋白、膽固醇等組成。外泌體內(nèi)含蛋白包括促膜融合的胞質(zhì)蛋白R(shí)abs家族及膜聯(lián)蛋白（膜聯(lián)蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅺ），跨膜蛋白（CD63、CD81和CD9），分子伴侶熱休克蛋白（HSP60、HSP70和HSP90）以及一些細(xì)胞特異性蛋白，如MHC-Ⅱ（抗原提呈細(xì)胞來(lái)源）等[6]。近年來(lái)，隨著研究的逐漸深入，現(xiàn)已證實(shí)除蛋白質(zhì)外，外泌體還攜帶多種核酸類物質(zhì)，如微小RNA（miRNA，包括miR-373、miR-200等）、lncRNA（包括FMR1-AS1、HISLA等）以及少量的circRNA（如circ-0044520）等，并通過(guò)此途徑參與細(xì)胞間物質(zhì)的傳遞[7]。

2 外泌體的生理學(xué)效應(yīng)

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶有多種生物活性物質(zhì)，細(xì)胞可以通過(guò)分泌外泌體與鄰近或遠(yuǎn)距離細(xì)胞膜融合，介導(dǎo)生物活性物質(zhì)由供體細(xì)胞向受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及在細(xì)胞間信息、物質(zhì)交流等方面發(fā)揮著重要的作用[8]。根據(jù)細(xì)胞和組織的來(lái)源不同，外泌體有著不同的生物學(xué)效應(yīng)，如來(lái)源自內(nèi)皮干細(xì)胞的外泌體中的miR-126和miR-296可促進(jìn)胰島血管內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成，該過(guò)程對(duì)于移植的胰島植入和存活至關(guān)重要。此外，外泌體還具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫調(diào)節(jié)作用[9]。

3 外泌體與腫瘤

腫瘤微環(huán)境主要由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)組成，可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，已有證據(jù)顯示腫瘤微環(huán)境可通過(guò)分泌蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)促進(jìn)正常細(xì)胞發(fā)生癌變及腫瘤進(jìn)展。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，除經(jīng)典途徑外，腫瘤微環(huán)境中的循環(huán)外泌體和靶細(xì)胞表達(dá)的跨膜分子之間的表面相互作用也可啟動(dòng)細(xì)胞間通訊。還有研究表明癌細(xì)胞比正常細(xì)胞分泌更多的外泌體，提示外泌體與腫瘤有著明顯相關(guān)性[10]。這些促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的外泌體既可來(lái)自非腫瘤細(xì)胞，也可來(lái)自腫瘤細(xì)胞，如侵襲性乳腺癌細(xì)胞可通過(guò)增加基質(zhì)細(xì)胞外泌體中的末端暴露的RN7SL1的含量，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及耐藥發(fā)生[11]。腫瘤來(lái)源的外泌體以自分泌或旁分泌等信號(hào)途徑影響其微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤新生血管形成、骨髓環(huán)境和腫瘤基質(zhì)重塑、促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、逃避機(jī)體免疫機(jī)制、產(chǎn)生化學(xué)抗性等[12]。如黑色素瘤[13]、膀胱癌[14]衍生的外泌體在腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和發(fā)展，還有研究表明腫瘤外泌體可分泌抑制自然殺傷細(xì)胞活性并誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的因子，為腫瘤自身創(chuàng)造了良好的生長(zhǎng)環(huán)境。

4 外泌體在卵巢癌化療耐藥方面的作用機(jī)制

卵巢癌是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，由于卵巢位于盆腔深部，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，晚期病變也缺乏有效的治療手段，因此卵巢癌致死率居?jì)D科惡性腫瘤首位。目前卵巢癌主要的治療方法為腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和手術(shù)后輔助紫杉醇聯(lián)合鉑類化療，初始反應(yīng)一般較好，然而，由耐藥性導(dǎo)致的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移十分常見[15]。大量研究發(fā)現(xiàn)，外泌體對(duì)于卵巢癌的化療耐藥性的發(fā)生可能起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。

4.1 卵巢癌細(xì)胞通過(guò)外泌體增加化療藥物的排出介導(dǎo)化療耐藥 Safaei等[16]的研究發(fā)現(xiàn)順鉑（CDDP）耐藥的卵巢癌細(xì)胞釋放出的外泌體中順鉑含量是CDDP敏感的卵巢癌細(xì)胞的2.6倍。卵巢癌細(xì)胞通過(guò)釋放出更多的外泌體來(lái)增加順鉑的排放，同時(shí)外泌體中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的增多也與耐藥產(chǎn)生有關(guān)。前期研究表明，正常情況下CDDP在溶酶體中濃縮，而CDDP抗性的腫瘤的溶酶體室明顯縮小，約為敏感細(xì)胞中的溶酶體區(qū)室的40%，并且外泌體釋放更多的CDDP輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括MRP2、ATP7A、ATP7B和溶酶體相關(guān)蛋白1（LAMP1）。近年來(lái)也有研究表明攜帶P-糖蛋白（P-gp）的外泌體與卵巢癌紫杉醇及阿霉素耐藥性有關(guān)。P-gp的作用是從細(xì)胞中外排化療藥物，維持化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的低濃度水平，其升高意味著對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)在膜結(jié)合蛋白水平，P-gp通過(guò)外泌體的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移途徑在人卵巢癌細(xì)胞之間實(shí)現(xiàn)“共享”。通過(guò)比較野生型親本系（A2780/WT）與紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞（A2780/PTX）發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞產(chǎn)生并釋放更多的外泌體，且A2780/PTX細(xì)胞分泌的外泌體攜帶大量P-gp，而A2780/WT細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到P-gp。由于高水平的P-gp表達(dá)，阿霉素不能進(jìn)入A2780/PTX細(xì)胞的細(xì)胞核而產(chǎn)生耐藥。此外，將卵巢癌耐藥細(xì)胞來(lái)源的外泌體與其親本系共孵育后，發(fā)現(xiàn)敏感細(xì)胞對(duì)阿霉素和紫杉醇的抗性均較未孵育前高出5倍。這提示外泌體中的P-gp促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇和阿霉素的耐藥性。也有研究表明外泌體中的肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）也可通過(guò)加速藥物排出細(xì)胞[18]，以及增加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）的表達(dá)[19]，介導(dǎo)卵巢癌化療耐藥發(fā)生。

4.2 膜聯(lián)蛋白A3（Annexin A3）的分泌增加可介導(dǎo)卵巢癌化療耐藥性的產(chǎn)生 Yan等[20]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Annexin A3（一種Ca2+和磷脂結(jié)合膜聯(lián)蛋白家族）的表達(dá)在鉑耐藥卵巢細(xì)胞系中顯著增加，且可能是通過(guò)阻止細(xì)胞中鉑的攝取或積累來(lái)介導(dǎo)卵巢癌耐藥。Yin等[21]的研究也表明，與親本細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3相比，鉑類耐藥卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780/Cis和SKOV3/Cis表達(dá)更高水平的Annexin A3，且Annexin A3高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中具有更多的囊泡，其中一些囊泡是Annexin A3+，提示Annexin A3的分泌可能與含有Annexin A3的囊泡的胞吐作用和外泌體的釋放有關(guān)。通過(guò)將20例鉑耐藥患者、30例鉑敏感患者與正常女性的血清進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鉑類耐藥卵巢癌患者的Annexin A3水平顯著升高。這些研究均提示，Annexin A3的增加可能與外泌體介導(dǎo)耐藥相關(guān)，可能成為卵巢癌及順鉑耐藥的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

4.3 外泌體通過(guò)誘導(dǎo)SMAD同源物4（SMAD4）突變誘導(dǎo)EMT來(lái)介導(dǎo)卵巢癌化療耐藥 SMAD是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）信號(hào)通路的效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，而SMAD4主要與受體激活的SMAD（SMAD2或SMAD3）結(jié)合，形成異二聚體，易位進(jìn)入細(xì)胞核后，在核內(nèi)與其他輔因子結(jié)合并啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[22]。Crow等[1]通過(guò)使用不同鉑類耐藥程度的卵巢癌細(xì)胞系來(lái)研究外泌體對(duì)耐藥性的影響，發(fā)現(xiàn)敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780細(xì)胞經(jīng)高度耐藥細(xì)胞C30和CP70分泌的外泌體預(yù)處理后，其細(xì)胞活力分別增加近1.5倍和2倍，同時(shí)細(xì)胞凋亡減少。當(dāng)用卡鉑耐藥的OVCAR10細(xì)胞分泌的外泌體處理A2780細(xì)胞時(shí)，也觀察到類似的結(jié)果。對(duì)卵巢癌細(xì)胞系進(jìn)行DNA測(cè)序結(jié)果顯示，在高度鉑耐藥細(xì)胞系（C30、CP70和OVCAR10）中均存在SMAD4的體細(xì)胞突變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鉑耐藥細(xì)胞系中EMT標(biāo)志物顯著上調(diào)，EMT標(biāo)志物已被確立為卵巢癌耐藥性的重要介質(zhì)。此外，用鉑耐藥細(xì)胞系衍生的外泌體處理敏感的A2780細(xì)胞后，EMT標(biāo)志物也會(huì)顯著上調(diào)。綜上，鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞可通過(guò)衍生的外泌體導(dǎo)致鉑類敏感的卵巢癌細(xì)胞發(fā)生SMAD4突變，進(jìn)而導(dǎo)致鉑類藥物敏感性降低。

4.4 miRNA通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移到鄰近基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)卵巢癌紫杉醇耐藥及惡性表型 Au Yeung等[23]發(fā)現(xiàn)miR-21可通過(guò)外泌體從基質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體卵巢癌細(xì)胞系SKOV3ip，并且轉(zhuǎn)移的miR-21的量取決于外泌體中遞送的miR-21的量。該研究用從miR-21+MEFs（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）及miR-21-MEFs分離出的同等量的外泌體處理2種卵巢癌細(xì)胞OVCA432和SKOV3，給予紫杉醇治療后顯示miR21+MEFs外泌體處理的細(xì)胞中殘留的細(xì)胞數(shù)量更高。將轉(zhuǎn)染miR-21的CAAs和CAFs來(lái)源的外泌體與SKOV3細(xì)胞共孵育后發(fā)現(xiàn)，凋亡酶激活因子1（APAF1）mRNA水平顯著降低，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)外泌體將miR-21遞送至卵巢癌細(xì)胞，并激活A(yù)PAF1來(lái)增加卵巢癌細(xì)胞的侵襲性及介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥。同時(shí)，另有研究也表明多個(gè)miRNA對(duì)卵巢癌耐藥起著重要的介導(dǎo)作用，如Pink等[24]研究發(fā)現(xiàn)miR-21-3p可能在卵巢癌細(xì)胞中通過(guò)靶向NAV3來(lái)誘導(dǎo)順鉑耐藥。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，外泌體具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)機(jī)體的生理病理都起重要的調(diào)控作用。卵巢癌源性的外泌體對(duì)于卵巢癌的早期診斷、耐藥形成及治療等方面的研究有著重要的臨床意義。目前研究發(fā)現(xiàn)外泌體對(duì)于卵巢癌化療耐藥的調(diào)節(jié)作用可能是一個(gè)重大的突破點(diǎn)，有望成為卵巢癌化療療效評(píng)估的潛在生物學(xué)標(biāo)志物及治療新靶點(diǎn)。然而目前外泌體的研究仍面臨一些困境，比如外泌體的分離提純等。隨著外泌體相關(guān)研究不斷深入，外泌體在卵巢癌化療耐藥方面的臨床應(yīng)用將為鉑類耐藥的卵巢癌的治療提供新的方法。