人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的分子表達(dá)變化

王賽賽，金海霞

1987年首例使用冷凍保存的MⅡ卵母細(xì)胞嬰兒出生，目前使用卵母細(xì)胞冷凍保存后出生的嬰兒約1 000余例，MⅡ期卵母細(xì)胞的成功冷凍保存，其發(fā)現(xiàn)和廣泛應(yīng)用是過去十年中人類輔助生殖的最大成功之一。隨著冷凍卵母細(xì)胞保存生育力的需求增加，其低溫保存越來越引起重視。盡管卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)已經(jīng)取得了很大的突破，且其成功率也逐年增高，但該技術(shù)尚未得到廣泛應(yīng)用。玻璃化冷凍（vitrification cryopreservation）技術(shù)是一種快速冷凍技術(shù)，其基本原理是利用高濃度的滲透性冷凍保護(hù)劑[如：乙二醇（EG）、二甲基亞砜（DMSO）、聚乙二醇等]和非滲透性保護(hù)劑蔗糖，經(jīng)急速降溫使脫水后樣本殘留的水分由液態(tài)轉(zhuǎn)化為類似玻璃的非晶體化狀態(tài)。卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存對(duì)隨后的胚胎發(fā)育有很大影響[1]，闡述其對(duì)卵母細(xì)胞的影響至關(guān)重要。

1 卵母細(xì)胞冷凍的必要性

在輔助生育過程中，胚胎冷凍起了重要的作用。但在某些特殊的情況下，必須進(jìn)行卵子的冷凍：①有些國家因?yàn)榉珊妥诮痰囊蛩?，不可以進(jìn)行胚胎的冷凍，但可以進(jìn)行卵子的冷凍，如西班牙；②取卵當(dāng)天男方未取到精子；③未婚的健康女性保存生育能力；④患有嚴(yán)重疾病影響生育功能的女性提早保存生育力；⑤一些夫婦要求冷凍女方卵子，而不是胚胎；⑥對(duì)于一些卵母細(xì)胞成熟障礙患者（如多囊卵巢綜合征）的生育力保存。

哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞是體內(nèi)最大的細(xì)胞，而且是一個(gè)體積/表面積大的細(xì)胞，由顆粒細(xì)胞和透明帶包圍，顆粒細(xì)胞又分為壁顆粒細(xì)胞（MGs）和卵丘細(xì)胞（CCs）。在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中，MGs主要作用為類固醇激素合成和在排卵過程中促進(jìn)卵泡壁破裂，CCs與卵母細(xì)胞之間通過縫隙連接和旁分泌信號(hào)通路進(jìn)行復(fù)雜的密切聯(lián)系，CCs主要與卵母細(xì)胞共同組成卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物（cumulus-oocyte complex，COCs），形成特定的局部微環(huán)境，其為卵母細(xì)胞提供三大代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)，影響卵泡發(fā)育的始終；CCs在竇卵泡階段通過縫隙連接傳遞環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）等維持卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂停滯；在卵母細(xì)胞成熟期，CCs和卵母細(xì)胞共同完成卵丘擴(kuò)張以及恢復(fù)減數(shù)分裂。

哺乳動(dòng)物未成熟卵母細(xì)胞包括MⅠ期和GⅤ期卵母細(xì)胞，因其本身特殊的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和低溫敏感性，冷凍可能會(huì)帶來一些問題，如大多數(shù)哺乳動(dòng)物（包括人類）的微管減數(shù)分裂紡錘體對(duì)冷卻非常敏感；冷凍可能導(dǎo)致不同程度的主軸瓦解；由于一些微管的松散或凝結(jié)導(dǎo)致染色體散在排列于細(xì)胞中。因不同減數(shù)分裂階段的卵母細(xì)胞可能對(duì)低溫保存表現(xiàn)出不同的敏感性，GⅤ期卵母細(xì)胞相較于MⅠ期卵母細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)較松散且有核膜包繞，比MⅠ期更能抵抗冷凍損傷及非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)，且未成熟卵母細(xì)胞比MⅡ階段的卵母細(xì)胞對(duì)低溫更敏感、細(xì)胞膜穩(wěn)定性更低[2]。

目前哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞因其特殊的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和低溫敏感性，導(dǎo)致玻璃化冷凍后有關(guān)卵母細(xì)胞成熟的基因表達(dá)障礙[3]，以及卵母細(xì)胞本身的染色體等的變化導(dǎo)致受精率降低及受精后多倍體形成增多[4]，其仍是最難的低溫保存細(xì)胞類型。

2 CCs在玻璃化冷凍中的作用

在正常卵泡發(fā)育過程中，CCs和卵母細(xì)胞聯(lián)系緊密，其能幫助轉(zhuǎn)運(yùn)卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中必須的營養(yǎng)物質(zhì)、信號(hào)分子以及代謝產(chǎn)物。研究認(rèn)為CCs對(duì)卵母細(xì)胞尤其未成熟卵母細(xì)胞冷凍保存有顯著的保護(hù)作用，相比裸卵母細(xì)胞（denuded oocyte，DO）冷凍保存，COCs的冷凍保存更有優(yōu)勢(shì)。CCs可以使得冷凍保護(hù)劑逐步滲透并且在解凍過程中防止?jié)B透壓劇烈變化對(duì)卵母細(xì)胞的損傷，因此卵母細(xì)胞存活率和受精率較裸卵母細(xì)胞顯著增加[5]。陳雅等[6]研究表明，玻璃化冷凍對(duì)有完整CCs的卵母細(xì)胞能減少對(duì)其細(xì)胞骨架的損傷，并可改善卵子復(fù)蘇及GⅤ期卵母細(xì)胞凍融后胚胎發(fā)育結(jié)局。而Kokotsaki等[7]研究表明，玻璃化冷凍后腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá)量增加，而其他凋亡基因[脂肪酸合成酶（FAS），B-細(xì)胞淋巴瘤因子2（BCL-2），Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）]或溫度相關(guān)基因[熱休克蛋白27（HSP27），HSP47，HSP70，RBM3-RNA結(jié)合序列蛋白3]不受影響，玻璃化冷凍影響人顆粒細(xì)胞的生存能力。

3 玻璃化冷凍卵母細(xì)胞分子及基因方面的研究

目前關(guān)于冷凍對(duì)卵母細(xì)胞影響的研究主要集中在卵母細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)的變化，而在分子和基因?qū)用嫔系难芯枯^少。隨著玻璃化冷凍技術(shù)逐漸發(fā)展與成熟，從分子及基因?qū)用嫣骄坎ＡЩ鋬鰧?duì)于卵母細(xì)胞的改變已成為研究熱點(diǎn)。有研究表明，玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞后有102個(gè)基因表達(dá)水平差異顯著，其中12個(gè)主要參與細(xì)胞周期、受精和糖代謝的基因上調(diào)，90個(gè)主要參與線粒體、核糖體蛋白、細(xì)胞骨架、跨膜蛋白、細(xì)胞周期和鈣離子的基因下調(diào)[8]。在卵母細(xì)胞成熟過程中，基因的及時(shí)表達(dá)對(duì)胚胎的進(jìn)一步發(fā)育具有重要意義，冷凍保存可能會(huì)對(duì)其造成不同程度的損害。研究表明，在人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍、蛋白質(zhì)泛素化降解機(jī)制相關(guān)基因及生長(zhǎng)激素信號(hào)通路相關(guān)基因[如胰島素生長(zhǎng)因子1受體（IGF1R）、胰島素受體底物1（IRS1）]均表達(dá)下調(diào)，其中影響最大的分子和細(xì)胞功能是細(xì)胞周期，包括在玻璃化冷凍MⅡ卵母細(xì)胞庫中特異性下調(diào)的mRNA多聚腺苷酸化基因[如蘇氨酸和酪氨酸激酶（TTK）、細(xì)胞周期蛋白A1（CCNA1）、微染色體維持10（MCM10）][9]。在人卵母細(xì)胞中，慢速冷凍和玻璃化冷凍均可誘導(dǎo)不同細(xì)胞器重塑和膜再循環(huán)以及減數(shù)分裂紡錘體重組[10]。

3.1 卵母細(xì)胞骨架的改變 細(xì)胞骨架由微絲、微管和中間絲三個(gè)纖維系統(tǒng)組成。其不僅是一個(gè)介導(dǎo)功能分化的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，而且還有助于許多細(xì)胞過程，如運(yùn)輸、有絲分裂、分泌、細(xì)胞擴(kuò)張的形成、細(xì)胞間通信和凋亡等?？p隙連接（gap junctions，GJs）由連接素（connexins，CXs）形成，其連接相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和半通道（hemichannels，HCs）。有研究分別對(duì)牦牛GⅤ期和體外成熟后MⅡ期卵母細(xì)胞分別進(jìn)行玻璃化冷凍[11]，發(fā)現(xiàn)與影響細(xì)胞骨架[如細(xì)胞角蛋白8（CK8），β肌動(dòng)蛋白（ACTB）]和縫隙連接（如GJA1）相關(guān)的基因在冷凍MⅡ期表達(dá)更高，這種差異可能導(dǎo)致體外成熟至MⅡ期卵母細(xì)胞后進(jìn)行玻璃化冷凍存活率更高。Morató等[12]通過對(duì)牛成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，發(fā)現(xiàn)在沒有添加細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑（紫杉醇）的卵母細(xì)胞中，紡錘體結(jié)構(gòu)異常或染色體分散或解離的比例明顯增高。研究表明，在對(duì)大鼠未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化后，對(duì)于細(xì)胞周期階段、染色質(zhì)和細(xì)胞骨架完整性的損害可能在受精后才會(huì)顯現(xiàn)出來[13]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，使用液氦玻璃化冷凍未成熟卵母細(xì)胞降低了低溫?fù)p傷對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響，提高了牛未成熟卵母細(xì)胞的存活能力[14]。

3.2 影響卵母細(xì)胞成熟的基因改變 臨床上常會(huì)出現(xiàn)卵母細(xì)胞不完全成熟或全部不成熟的患者，玻璃化冷凍也可影響與卵母細(xì)胞成熟有關(guān)的基因改變。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族有超過35個(gè)成員，其對(duì)卵巢功能作用顯著，骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）和生長(zhǎng)分化因子9（GD F9）基因是TGF-β超家族的相關(guān)成員，其中GDF9廣泛表達(dá)于各器官組織，但在卵巢組織中高表達(dá)，而BMP15只在卵巢表達(dá)，它們是影響卵泡生長(zhǎng)發(fā)育和卵巢功能較為重要的卵母細(xì)胞分泌因子（OSFs）。Dong等[15]首次于小鼠體內(nèi)證明GDF9影響卵泡發(fā)育。近年研究表明COCs中一些基因（如GDF9和BMP15）的表達(dá)可影響卵母細(xì)胞的成熟。Liu等[16]通過對(duì)牛卵母細(xì)胞的研究表明，BMP15和GDF9具有協(xié)同作用，可以通過作用于miR-375進(jìn)而影響Ⅰ型受體活化蛋白受體樣激酶4（ALK4）和Ⅱ型受體骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2（BMPR2）的表達(dá)水平和Smad信號(hào)通路的激活，影響卵丘細(xì)胞增殖、擴(kuò)張和凋亡。另有研究表明，GDF9和BMP15的基因表達(dá)可抑制卵丘細(xì)胞凋亡[17-18]。那么玻璃化冷凍未成熟卵母細(xì)胞是否影響基因的改變呢，Azari等[19]分別對(duì)牛的未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍后的COCs中GDF9和BMP15表達(dá)水平相對(duì)較低，且可降低核成熟率和卵裂率，說明玻璃化冷凍可使影響卵母細(xì)胞成熟的基因（如GDF9和BMP15）表達(dá)下降，進(jìn)而降低卵母細(xì)胞成熟率。另有學(xué)者在綿羊COCs玻璃化冷凍后，發(fā)現(xiàn)成熟基因（GDF9、BMP15）等表達(dá)受阻[3]。

目前探討基因轉(zhuǎn)錄水平與卵母細(xì)胞成熟的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)，微小RNA（miRNA）是一類小的（19～25 bp）非編碼RNA，通過控制mRNA穩(wěn)定性或翻譯來多樣地調(diào)節(jié)基因表達(dá)[20]。這些非編碼RNA的功能仍然相對(duì)未知，其是影響生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡的重要細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn)在豬卵母細(xì)胞成熟過程中，miR-378的過表達(dá)抑制了卵母細(xì)胞從GⅤ到MⅡ期的進(jìn)展[21]。CCs中miR-378的過表達(dá)抑制了與卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因的表達(dá)，在CCs中miR-378的過表達(dá)抑制了CYP19A1基因[由卵巢卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生的雄激素通過細(xì)胞色素P450芳香酶（由CYP19A1基因編碼）轉(zhuǎn)化為雌二醇（E2）]的表達(dá)，導(dǎo)致E2含量顯著下降，并發(fā)現(xiàn)在早期成熟培養(yǎng)基中補(bǔ)充E2可以逆轉(zhuǎn)miR-378對(duì)減數(shù)分裂進(jìn)程的影響，提示通過靶向芳香酶抑制E2的產(chǎn)生可能是miR-378調(diào)控COCs成熟的機(jī)制之一[21-22]。有研究表明，在小鼠體內(nèi)進(jìn)行miR-378過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其改變了CCs中的基因表達(dá)，并可能通過抑制卵母細(xì)胞-CCs相互作用或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡間接影響卵母細(xì)胞成熟能力[23]。

3.3 影響卵母細(xì)胞凋亡的基因改變 在哺乳動(dòng)物生育細(xì)胞體系中，正常程序化死亡占99.9%，其最終可導(dǎo)致不孕和卵巢功能衰竭。目前，卵母細(xì)胞的存活仍是未成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍/解凍后所面臨的主要難題，Men等[24]研究表明，玻璃化冷凍可使牛卵母細(xì)胞在隨后培養(yǎng)過程中通過細(xì)胞凋亡而退化。BCL2是抗凋亡基因，其促進(jìn)細(xì)胞存活；BAX是促凋亡基因，其促進(jìn)細(xì)胞死亡；P53是抑癌基因，其維持基因組的完整，修復(fù)缺陷基因。有研究表明，在對(duì)山羊未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍后，發(fā)現(xiàn)BAX/BCL2比值增加，并表明在玻璃化GⅤ期卵母細(xì)胞后凋亡基因（Fas、FasL、Bax和Bcl-2）的上調(diào)可能是玻璃化后發(fā)育能力下降的早期指標(biāo)[25]。Dai等[26]發(fā)現(xiàn)在豬的卵母細(xì)胞玻璃化過程中，線粒體的功能和形態(tài)遭到很大的破壞，而且在凍融后可出現(xiàn)早期凋亡，表明內(nèi)源性線粒體通路也可能參與卵母細(xì)胞玻璃化后的凋亡。

3.4 影響卵母細(xì)胞發(fā)育能力的基因改變 研究已證明玻璃化冷凍會(huì)降低哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，這與玻璃化卵母細(xì)胞的異常mRNA表達(dá)密切相關(guān)，Shirazi等[27]發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞玻璃化過程中，有8個(gè)基因參與了卵母細(xì)胞表觀遺傳修飾[DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3β（DNMT3B），組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶1（HAT1），組蛋白去乙酰化酶1（HDAC1），DNMT1]、染色體重塑[肌動(dòng)蛋白依賴的染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子1（SMARCAL1）]和轉(zhuǎn)錄[信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）]，在卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化后HDAC1表達(dá)減少，而STAT3、SMARCAL1和DNMT3B表達(dá)增加，基因組不同程度的激活可能是影響玻璃化冷凍后卵母細(xì)胞發(fā)育能力的原因。

3.5 玻璃化冷凍對(duì)于脂質(zhì)代謝的影響 脂質(zhì)作為細(xì)胞的一種能量物質(zhì)和細(xì)胞組成成分在卵母細(xì)胞中大量存在，已有假設(shè)認(rèn)為細(xì)胞脂質(zhì)和細(xì)胞骨架充分之間的聯(lián)系非常緊密，冷凍時(shí)脂質(zhì)變硬，可導(dǎo)致骨架結(jié)構(gòu)的變形和瓦解，有些可致永久性損傷。Schwarz等[28]通過對(duì)牛COC和胚胎的研究表明，環(huán)磷酸鳥苷依賴的蛋白激酶（cGMP-PKG）途徑參與控制卵母細(xì)胞的脂解作用，cGMP水平與脂質(zhì)間呈負(fù)相關(guān)，在體外成熟（in vitro maturation，IVM）和體外培養(yǎng)（in vitro culture，IVC），cGMP可能通過影響脂解相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控CCs的脂質(zhì)含量，在胚胎中可能通過抑制cGMP水解降低脂質(zhì)含量，但其不改善胚胎冷凍耐受性。

4 結(jié)語

卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)是保存女性生育力的主要途徑，但冷凍保存易對(duì)卵母細(xì)胞造成不可逆的損傷。目前的研究主要集中在動(dòng)物（如牛、羊和豬等），還未有任何研究從分子層面全面分析玻璃化冷凍對(duì)人卵母細(xì)胞尤其未成熟卵母細(xì)胞的損傷以及CCs在未成熟卵母細(xì)胞冷凍保存中對(duì)基因表達(dá)的影響，進(jìn)而為完善未成熟卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)提供有力的證據(jù)。雖然人全基因組表達(dá)芯片技術(shù)在人卵母細(xì)胞甚至單個(gè)卵母細(xì)胞上成功應(yīng)用，但是該技術(shù)還未用于研究卵母細(xì)胞凍存過程中的基因表達(dá)變化，這仍有待探討。隨著輔助生殖技術(shù)（ART）的廣泛應(yīng)用，給不孕患者帶來了福音，卵母細(xì)胞冷凍不可或缺，尤其適用于那些激素不敏感型、卵巢過度刺激綜合征（OHSS）及多囊卵巢綜合征（PCOS）患者，也可適用于激素敏感型患者在應(yīng)用促排卵藥前保留生育力。