表面增強(qiáng)拉曼光譜在腫瘤實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用

張晨曦，孫 波，劉佳佳，劉書(shū)筠，張文麗，高 明，王亞?wèn)|， 高 陽(yáng)，呂 虹，張國(guó)軍，2，樊瑜波 綜述，康熙雄，2，△ 審校

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100071；2.北京市免疫試劑臨床工程技術(shù)研究中心，北京 100050；3.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191)

目前癌癥仍然是世界各地所面臨的重大挑戰(zhàn)，迫切需要開(kāi)發(fā)用于癌癥早期篩查、診斷和術(shù)中手術(shù)指導(dǎo)的新技術(shù)。拉曼光譜作為一種新型分子光譜，檢測(cè)生物樣本時(shí)具有免標(biāo)、不間斷、原位檢測(cè)等多種優(yōu)勢(shì)，近幾十年里，該技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用日益增加[1]。拉曼光譜是1928年印度物理學(xué)家RAMAN發(fā)現(xiàn)的一種非彈性散射光譜，它用于研究分子的振動(dòng)，能根據(jù)分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)或振動(dòng)能級(jí)確定分子結(jié)構(gòu)，是一種振動(dòng)的分子指紋光譜[2]。拉曼光譜作為一種分子指紋光譜，檢測(cè)樣品具有分析速度快、操作簡(jiǎn)單、使用范圍廣、抗干擾能力強(qiáng)等明顯的優(yōu)勢(shì)[3]。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)是指將待測(cè)物分子吸附在粗糙的納米金屬材料表面，由于拉曼的信號(hào)較弱，SERS技術(shù)可使待測(cè)物的拉曼信號(hào)增強(qiáng)106～1 015倍，解決了普通拉曼光譜靈敏度低的問(wèn)題[4]。生物體系中與代謝相關(guān)的信息主要通過(guò)蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物分子的含量、種類以及結(jié)構(gòu)的變化來(lái)體現(xiàn)，近幾年SERS技術(shù)在腫瘤檢測(cè)方面得到初步發(fā)展，原因是癌變的血清中的各個(gè)成分會(huì)發(fā)生微小變化，一般方法很難檢測(cè)到，而利用SERS技術(shù)能夠檢測(cè)腫瘤血清及其組織中分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)象的微小變化；由于生物樣本信號(hào)的熒光背景干擾比較大，SERS技術(shù)可以減弱甚至避免相應(yīng)的熒光背景干擾，因此根據(jù)表面增強(qiáng)拉曼光譜的改變可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期篩查、診斷以及指導(dǎo)治療[5-6]。與傳統(tǒng)免疫學(xué)、電化學(xué)等檢測(cè)技術(shù)相比，SERS技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是直接分析、無(wú)標(biāo)記檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單；同時(shí)避免了傳統(tǒng)方法中抗體應(yīng)用，特別是單克隆抗體高花費(fèi)等的問(wèn)題[7-8]。

1 表面增強(qiáng)拉曼光譜在腫瘤血清標(biāo)本中的應(yīng)用

利用SERS技術(shù)分析人體血清SERS，可對(duì)血清內(nèi)含有的各種生物分子的性質(zhì)是否發(fā)生改變有更深層次的了解，從而判斷身體功能變化。目前文獻(xiàn)報(bào)道，利用SERS技術(shù)可以檢測(cè)肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、腮腺腫瘤、前列腺癌等血清標(biāo)本，從而實(shí)現(xiàn)疾病的快速篩查、診斷[9]。

1.1肝癌 SHAO等[10]研究探索了一種快速無(wú)損的肝臟疾病檢測(cè)技術(shù)-SERS技術(shù)，實(shí)現(xiàn)肝臟疾病的早期診斷、預(yù)防和治療。此實(shí)驗(yàn)測(cè)試304例健康者，333例肝病患者(48例慢性乙型肝炎、49例代償性肝硬化、48例失代償期肝硬化、46例0期肝細(xì)胞癌、46例1期肝細(xì)胞癌、49例2期肝細(xì)胞癌、47例3期肝細(xì)胞癌)和99名食管癌患者的血清標(biāo)本，分別從以下方面進(jìn)行譜圖比較：(1)對(duì)比健康者、肝病組、食管癌組發(fā)現(xiàn)：在724、958、1 326和1 655 cm-1位移處，患病組峰高低于對(duì)照組，在638、811、888、1 021、1 132和1 218 cm-1位移處，患病組峰高高于對(duì)照組，除1 655 cm-1位移處，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)對(duì)比慢性肝病組(慢性乙型肝炎、肝硬化代償期、肝硬化失代償期)與肝細(xì)胞癌組發(fā)現(xiàn)：在位移1 218、1 339、1 438和1 580 cm-1位移處，慢性肝病組峰高更明顯，在位移811和1 021 cm-1處，肝細(xì)胞癌組峰高最明顯，除1 438 cm-1外，所有峰均顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(3)對(duì)比慢性乙型肝炎、肝硬化代償期、肝硬化失代償這3組發(fā)現(xiàn)：在638、681、809、1 068、1 218、1 350、1 444和1 661 cm-1位移處，除1 218 cm-1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(4)對(duì)比不同分期的肝細(xì)胞癌組發(fā)現(xiàn)：在位移684、743、1 021、1 219、1 339、1 441、1 659 cm-1位移處，除1 219和1 441 cm-1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在這項(xiàng)研究中，通過(guò)檢測(cè)血清的SERS信號(hào)并結(jié)合偏最小二乘法-線性判別分析(OPLS-DA)進(jìn)行光譜分析，結(jié)果表明該方法對(duì)肝病的分類具有準(zhǔn)確率較高、靈敏度好、檢測(cè)快速等特點(diǎn)。因此，利用SERS技術(shù)聯(lián)合OPLS-DA是一種肝臟疾病診斷的快速且非侵入性的新技術(shù)。

邵麗婷等[11]通過(guò)比較30例健康者與48例慢性乙肝、48例肝硬變和46例肝癌患者血清之間的拉曼光譜差異，結(jié)果表明健康者與3組肝病患者血清在位移625、725、806、947、1 018、1 219、1 131、1 329、1 440、1 580和1 660 cm-1處均有拉曼峰，且峰強(qiáng)弱存在差異；健康者血清在位移1 096和1 395 cm-1處有強(qiáng)峰，肝病患者血清在位移887 cm-1有強(qiáng)峰。受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積(AUC)分別為0.981、0.966、0.984，結(jié)果表明基于OPLS-DA的血清SERS分類方法可作為肝病早期診斷分類的一種便捷輔助手段。

1.2乳腺癌 有很多研究報(bào)道利用SERS技術(shù)診斷乳腺癌，VARGAS-OBIETA等[12]測(cè)試了12例早期乳腺癌患者和15例健康對(duì)照者的血清，通過(guò)光譜分析，乳腺癌和對(duì)照者之間的主要差異是癌癥譜中622(苯丙氨酸)、642(酪氨酸)、695、714(多糖)、742(脂質(zhì))、754、875(色氨酸)和1 083(磷脂)cm-1位移處的強(qiáng)度增加以及在1 002(苯丙氨酸)、1 155(β胡蘿卜素)、1 328(色氨酸)和1 556(色氨酸)cm-1位移處的強(qiáng)度下降。這表明，與健康對(duì)照者相比，乳腺癌患者血清中某些生物分子的總SERS活性成分的百分比有所增加或減少；并結(jié)合主成分分析-線性判別分析(PCA-LDA)分類方法，區(qū)分乳腺癌與健康者的靈敏度和特異度分別為96%和87%；初步結(jié)果表明，SERS技術(shù)和PCA-LDA聯(lián)用可用于區(qū)分對(duì)照組和癌癥組，并且具有高靈敏度和特異度。

1.3口腔細(xì)胞癌 TAN等[13]研究了基于金納米粒子的血清表面增強(qiáng)拉曼光譜用于口腔鱗狀細(xì)胞癌的診斷，此實(shí)驗(yàn)選取135例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者、90例粘液表皮樣癌患者和145例健康對(duì)照者，通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析得出：與健康對(duì)照組相比，口腔鱗狀細(xì)胞癌組在位移294、446、548、726、745、1 136、1 263、1 371、1 445和1 491 cm-1，峰高增加，在位移1 542和1 602 cm-1，峰高降低；與黏液表皮樣癌組相比，口腔鱗狀細(xì)胞癌組在位移294、1 139、1 263和1 491 cm-1處峰高增加，在位移1 602 cm-1處峰高降低；并結(jié)合PCA-LDA結(jié)果顯示，口腔鱗狀細(xì)胞癌可以成功地與健康對(duì)照組進(jìn)行區(qū)分，靈敏度為80.7%，特異度為84.1%。交叉驗(yàn)證的過(guò)程證明PCA-LDA分析的結(jié)果是可靠的。

1.4前列腺癌 CHEN等[14]利用SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)前列腺癌與良性前列腺增生(前列腺特異性抗原濃度為4～10 ng/mL)的區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)選取40例前列腺癌與40例良性前列腺增生的患者血清，前列腺癌組在位移637、808和1 655 cm-1處有更高的峰強(qiáng)度，而在位移492、727、743、960、1 314、1 208、1 326、1 445、1 537 cm-1處顯示出更低的峰強(qiáng)度，表明這些差異可能會(huì)實(shí)現(xiàn)二者的區(qū)分，同時(shí)結(jié)合主成分分析和線性判別分析診斷算法，最終得出結(jié)論，SERS技術(shù)可能是一種很有前途的臨床工具，用于提高前列腺特異性抗原濃度處于灰色區(qū)域的某些前列腺癌患者的活檢陽(yáng)性率。

p53是一種強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄因子，在預(yù)防癌癥發(fā)展和保持基因組完整性過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在許多腫瘤中，發(fā)現(xiàn)該抑制劑基因突變后出現(xiàn)功能失活。因此檢測(cè)p53在癌癥的診斷及治療過(guò)程中有著重要的意義[15]。BIZZARRI等[16]利用SERS技術(shù)聯(lián)合免疫技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)患者血清，實(shí)現(xiàn)p53野生型與突變型的區(qū)分，表明該技術(shù)為腫瘤的早期診斷提供一種新型檢測(cè)方法。

2 表面增強(qiáng)拉曼光譜在腫瘤組織標(biāo)本中的應(yīng)用

SERS技術(shù)在研究癌癥細(xì)胞中也有一定的應(yīng)用，腫瘤組織與正常組織的差異主要表現(xiàn)在細(xì)胞水平，包括與正常組織細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、形態(tài)和細(xì)胞行為方面存在不同程度上的差異。拉曼光譜作為一種新型的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法，可以反映正常組織到癌變的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的生化組成和結(jié)構(gòu)的改變，不但可以避免組織活檢給患者帶來(lái)的痛苦與負(fù)擔(dān),而且可以彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)方式中存在的不足[17]，通過(guò)對(duì)比正常與異常組織的特征光譜，從而鑒別正常與異常組織，在腫瘤的診斷上有一定應(yīng)用價(jià)值。

2.1肺癌 佟倜等[18]利用SERS技術(shù)檢測(cè)肺腺癌組織與正常組織，結(jié)果表明癌變組織具有比癌旁正常組織更強(qiáng)的拉曼信號(hào)峰,并且分析了位于1 250、1 344、408、1 568、1 608和2 560 cm-1附近的拉曼峰分別與蛋白質(zhì)的Amide Ⅱ氨基化合物、C-H彎曲振動(dòng)、核酸中CH3的對(duì)稱變角振動(dòng)、蛋白質(zhì)色氨酸惰性環(huán)振動(dòng)、蛋白質(zhì)酰胺I譜帶分子間反平行β-折疊的C-O健伸縮振動(dòng)和蛋白質(zhì)的巰基(S-H)伸縮振動(dòng)有關(guān)，2 936 cm-1附近的拉曼峰為蛋白質(zhì)CH2的對(duì)稱伸縮振動(dòng)和CH3的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)共同作用產(chǎn)生。通過(guò)此實(shí)驗(yàn)表明，Au/Cu NRs能夠作為基底應(yīng)用于癌組織的SERS檢測(cè)，從而在分子水平上區(qū)分正常組織和癌變組織，為病理學(xué)診斷提供一定參考。

2.2胃癌 鞏龍靜[19]利用SERS技術(shù)檢測(cè)胃癌組織與正常組織，結(jié)果表明相比于正常組織，癌組織在724、1 329、1 367和1 597 cm-1處峰強(qiáng)度較高，在828和1 002 cm-1處峰強(qiáng)度較低；通過(guò)分析，癌組織中大部分蛋白質(zhì)、糖類及脂類含量較低，核酸含量較高，這是由于癌細(xì)胞的新陳代謝較正常細(xì)胞活躍，導(dǎo)致大部分的蛋白質(zhì)、脂類及提供能量的糖類消耗較大，難以在組織和細(xì)胞中聚集，因而在癌組織中含量較低。并通過(guò)此實(shí)驗(yàn)證明了胃組織的SERS信號(hào)比普通拉曼信號(hào)有明顯的增強(qiáng)。這就體現(xiàn)出SERS作為拉曼光譜衍生技術(shù)，繼承其優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，還具有高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)[3]。

2.3腦膠質(zhì)瘤 UCKERMANN等[20]利用拉曼光譜檢測(cè)人類腦膠質(zhì)瘤中的IDH1突變誘導(dǎo)的化學(xué)改變，拉曼光譜分析顯示IDH1突變型腦膠質(zhì)瘤中與DNA相關(guān)的光譜帶強(qiáng)度增加，歸屬于蛋白質(zhì)的拉曼條帶的強(qiáng)度在IDH1突變型和IDH1野生型腦膠質(zhì)瘤中有所不同，此外，分配到脂質(zhì)分子的光譜帶亦顯著減少。而且通過(guò)選擇5條光譜帶(498、826、1 003、1 174和1 337 cm-1)，實(shí)現(xiàn)了利用拉曼光譜對(duì)IDH1基因型進(jìn)行分類，正確率為89%。

3 表面增強(qiáng)拉曼光譜在其他實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1尿液與前列腺癌 DEL MISTRO等[21]利用尿液的表面增強(qiáng)拉曼光譜，對(duì)健康者與前列腺癌患者的尿液進(jìn)行了初探。此實(shí)驗(yàn)收集9例接受根治性前列腺切除術(shù)的前列腺癌患者[年齡(56±4)歲]與9例健康受試者[年齡(64±5)歲]的尿液標(biāo)本，聯(lián)合使用PCA發(fā)現(xiàn)前列腺癌組和對(duì)照組的SERS光譜之間的光譜差異，利用光譜數(shù)據(jù)的主成分分析和線性判別分析建立一種分類模型，最終區(qū)分前列腺癌患者與健康對(duì)照組的靈敏度為100%，特異度為89%，整體診斷準(zhǔn)確率為95%。結(jié)合已有文獻(xiàn)得知在拉曼位移721、958、1 084和1 461 cm-1處的峰全部歸屬于次黃嘌呤，而通過(guò)此次SERS分析，得到這種代謝物在前列腺癌樣品中比健康對(duì)照組中更豐富[22-23]。即使考慮到本報(bào)告中涉及的樣本數(shù)量非常有限，此方法的初步結(jié)果亦表明利用SERS技術(shù)檢測(cè)尿液來(lái)診斷疾病也是非常有前景的。

3.2唾液與肺癌 QIAN等[24]等研究了61例肺癌患者和66例健康對(duì)照者的唾液樣本，結(jié)果顯示肺癌患者的峰譜高度低于健康者，且二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)分析了腫瘤相關(guān)的12個(gè)特征峰。統(tǒng)計(jì)分析分類時(shí)使用支持向量機(jī)和隨機(jī)森林算法，基于支持向量機(jī)的留一法交叉驗(yàn)證的靈敏度為95.08%，特異度為100%。隨機(jī)森林法的靈敏度為96.72%，特異度是100%。此結(jié)果證明SERS技術(shù)對(duì)肺癌檢測(cè)有潛在應(yīng)用價(jià)值。

3.3細(xì)胞裂解產(chǎn)物與腫瘤分類 HASSOUN等[25]通過(guò)SERS技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞裂解物從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的分類，該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Capan-1、HepG2、Sk-Hep1和MCF-7 4株細(xì)胞系，建立相應(yīng)的分類方法以及后期交叉驗(yàn)證，模型的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度均超過(guò)96%，通過(guò)此研究證明了該技術(shù)在細(xì)胞鑒定中的應(yīng)用前景。

此外，亦有研究表明，通過(guò)SERE技術(shù)聯(lián)合親和層析方法檢測(cè)尿液里的修飾核苷，以無(wú)創(chuàng)檢測(cè)手段實(shí)現(xiàn)了鼻咽癌患者、食道癌患者與健康志愿者的區(qū)分，應(yīng)用偏最小二乘和線性判別分析(PLS-DA)，其診斷的靈敏度分別為95.2%、90.9%和98.1%，特異度分別為97.2 %、98.2%和95.7%；這些結(jié)果證明了這種新方法在非侵入性和無(wú)標(biāo)記癌癥篩選、檢測(cè)方面的巨大潛力[26]。

4 小結(jié)與展望

拉曼光譜作為一種分子指紋光譜，檢測(cè)樣品具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、檢測(cè)范圍廣等明顯的優(yōu)勢(shì)。SERS作為其衍生技術(shù)，繼承其優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，還具有高靈敏度、高特異度等優(yōu)點(diǎn)，在今后醫(yī)學(xué)診療應(yīng)用中大有前景。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，不管是利用SERS技術(shù)檢測(cè)體液標(biāo)本或是組織標(biāo)本，均可以實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)檢測(cè)，為臨床初篩、診斷、治療爭(zhēng)取最佳時(shí)機(jī)。但該檢測(cè)方法亦受到很多限制，比如背景信號(hào)干擾、臨床應(yīng)用不成熟、表面增強(qiáng)的基底比如金、銀納米溶膠的制備及應(yīng)用等，但結(jié)合其優(yōu)勢(shì)及后期研發(fā)、改進(jìn)措施，該技術(shù)有望成為新型醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)。