液態(tài)活檢在肺癌研究中的進(jìn)展

相綠竹，趙 琦，彭 瑞，王 曄 綜述,牟曉峰△ 審校

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部,山東青島 266021；2.青島市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東青島 266042)

液態(tài)活檢是指通過檢測(cè)患者的血液、尿液、胸腹水、唾液、腦脊液等體液中的DNA、RNA、蛋白質(zhì)來獲取腫瘤相關(guān)信息的一類非侵入性病理檢測(cè)方法。該技術(shù)最早出現(xiàn)于1974年SORRELS[1]利用關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑液診斷滑膜炎的研究中，如今已廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床診療。相比于創(chuàng)傷性、單點(diǎn)取樣的腫瘤組織活檢，液態(tài)活檢具有非侵入性、方便快捷、可多點(diǎn)多次多層面取樣等優(yōu)勢(shì)，能夠較好地克服腫瘤異質(zhì)性，特別是在無法獲取組織標(biāo)本的情況下能夠比較全面地反映腫瘤信息，在一定程度上彌補(bǔ)組織活檢的不足。肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率極高，嚴(yán)重威脅著人類的健康[2]。本文從液態(tài)活檢的研究?jī)?nèi)容、檢測(cè)技術(shù)以及在肺癌的早期診斷、靶向治療、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估等方面的臨床應(yīng)用進(jìn)行闡述，展現(xiàn)出液態(tài)活檢在肺癌研究領(lǐng)域中的巨大潛力，為肺癌的臨床診療提供新的手段與策略，加快精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

1 液態(tài)活檢的研究?jī)?nèi)容

1.1循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC) CTC是指由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落入血的腫瘤細(xì)胞，于1869年首次發(fā)現(xiàn)，半衰期約1.0～2.4 h，可單個(gè)存在或形成循環(huán)腫瘤微栓[3]。外周血中CTC水平很低，在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者中每1×109個(gè)血細(xì)胞中大約有1個(gè)CTC，有研究發(fā)現(xiàn)每7.5 mL外周血中CTC< 2個(gè)的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的總生存期為11.2個(gè)月，無進(jìn)展生存期為6.2個(gè)月，而CTC≥2個(gè)的NSCLC患者的總生存期為8.3個(gè)月，無進(jìn)展生存期為4.3個(gè)月，且NSCLC進(jìn)展組的CTC數(shù)量高于對(duì)照組[4]，可以看出CTC數(shù)量可作為肺癌進(jìn)展和預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)；一般認(rèn)為CTC表面上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)和細(xì)胞角蛋白(CK)陽性表達(dá)，白細(xì)胞特異度抗原CD45陰性表達(dá)，其惡性表型的細(xì)胞形態(tài)和攜帶的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等信息為研究者提供了從細(xì)胞層面和亞細(xì)胞層面分析腫瘤細(xì)胞的機(jī)會(huì)，而且CTC具有干細(xì)胞特性，能夠發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞的遷移、侵襲和耐藥性的形成[5]；此外，體外培養(yǎng)分離的CTC可以構(gòu)建CTC細(xì)胞系和CTC的異種移植物模型(CDXs模型)，HODGKINSON等[6]發(fā)現(xiàn)由小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者的CTC構(gòu)建的CDXs對(duì)化療的反應(yīng)與患者對(duì)化療的反應(yīng)相似，這對(duì)于藥物的篩選和促進(jìn)個(gè)體化治療具有重要意義。

1.2循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA) 前人研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血中循環(huán)游離DNA(cfDNA)水平明顯高于非腫瘤患者，且cfDNA攜帶癌基因/抑癌基因突變、拷貝數(shù)差異、融合基因、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、甲基化狀態(tài)等腫瘤相關(guān)信息。進(jìn)一步研究后把來自原位腫瘤、轉(zhuǎn)移灶中凋亡與壞死的細(xì)胞或者CTC中釋放的攜帶腫瘤相關(guān)信息的游離DNA稱為ctDNA[7]。一般來說，ctDNA的相對(duì)分子質(zhì)量比cfDNA低，且以碎片化呈現(xiàn)，半衰期16.0 min至2.5 h，具有潛在的致瘤性[8]；ctDNA的水平高于CTC且較容易獲得，其攜帶的基因突變信息為肺癌患者的靶向治療提供了依據(jù)，美國食品和藥品管理局2016年批準(zhǔn)ctDNA可用于檢測(cè)NSCLC患者是否存在表皮生長因子受體(EGFR)突變，以指導(dǎo)NSCLC患者靶向用藥；有研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者的血清cfDNA水平顯著高于健康對(duì)照組，且其水平與NSCLC分期相關(guān)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)與影像學(xué)相比，cfDNA水平變化可提前1～7個(gè)月監(jiān)測(cè)到NSCLC患者的疾病進(jìn)展[9]。

1.3外泌體 外泌體是由內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的直徑為40～100 nm、密度為1.13～1.19 g/m的一種胞外囊泡，表面有CD9、CD63、CD81等特異性標(biāo)志物，在血液、尿液、胸腹水等體液中均存在；腫瘤細(xì)胞來源的外泌體具有促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成，增加細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲能力，介導(dǎo)腫瘤免疫抑制等作用[10]；其富含DNA片段、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，能反映來源細(xì)胞的生物學(xué)特性，研究發(fā)現(xiàn)外泌體所攜帶的miR-21和miR-4257的表達(dá)上調(diào)與NSCLC的復(fù)發(fā)有關(guān)，其表達(dá)水平與患者的生存期呈負(fù)相關(guān)[11]，這對(duì)肺癌的進(jìn)展和患者的預(yù)后具有潛在的提示作用。

1.4其他液態(tài)活檢研究?jī)?nèi)容 循環(huán)腫瘤RNA(ctRNA)：1996年首次在黑色素瘤患者的血液中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)在多種腫瘤患者的外周血中發(fā)現(xiàn)存在mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等ctRNA。與ctDNA不同的是，ctRNA所攜帶的信息可以反映腫瘤患者轉(zhuǎn)錄水平、表觀遺傳水平以及其他機(jī)制引起的基因表達(dá)譜的改變[12]。因此，ctRNA的分析在腫瘤研究中具有巨大的潛在價(jià)值。

腫瘤化血小板(TEPs)：腫瘤細(xì)胞將腫瘤相關(guān)分子轉(zhuǎn)移至血小板，使其RNA和蛋白質(zhì)發(fā)生改變，成為TEPs。TEPs被認(rèn)為是機(jī)體對(duì)腫瘤的一種反應(yīng)，其水平豐富、易分離獲得，可促進(jìn)腫瘤的生長與播散，但具體機(jī)制尚未明確[13]。有研究者用迭代算法和“swarm-intelligence”對(duì)NSCLC患者TEPs RNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TEPs診斷Ⅰ～Ⅲ期 NSCLC(>100個(gè)樣本)的準(zhǔn)確度為81%，診斷晚期NSCLC(> 500個(gè)樣本)的準(zhǔn)確率為89%[14]，這提示TEPs RNA在肺癌的輔助診斷方面的價(jià)值不容忽視。

腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(TECs)：不存在于正常組織中，其形態(tài)多樣、排列無序，可通過分泌一種稱為biglycan的蛋白與腫瘤細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移播散[15]。目前仍處于研究階段，還需要大量的臨床驗(yàn)證。

2 液態(tài)活檢的相關(guān)技術(shù)

2.1液態(tài)活檢的捕獲技術(shù)

CTC的富集：目前CTC的富集方法有基于腫瘤細(xì)胞大小的膜過濾法、基于細(xì)胞密度的密度梯度離心法、基于EpCAM+CK+CD45-等表面標(biāo)志物的捕獲法(Cellsearch、微流控技術(shù)、多肽納米磁珠法)和差相富集技術(shù)[2]。當(dāng)然還有基于3D納米基質(zhì)、分層納米線芯片等富集方法，對(duì)CTC的富集效果也不錯(cuò)[16]。

ctDNA與ctRNA的提?。号R床研究中ctDNA與ctRNA的提取有商品化試劑盒，如Qiagen DNA提取試劑盒、SPLIT RNA提取試劑盒等，操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用廣泛。

外泌體的分離：除了密度梯度超速離心和免疫磁珠捕獲的方法提取外泌體外，超濾離心法和ExoQuick試劑盒能夠更加快速有效地提取外泌體。有研究者開發(fā)了一種基于新型聲波流體技術(shù)的聲波篩選裝置：用一個(gè)微流體通道去除血液樣本中的細(xì)胞和血小板，接著在聲波頻率較高的裝置內(nèi)把外泌體與較大的胞外囊泡分開，這種方法同樣可以有效地提取外泌體[17]。

TEPs的富集：血小板水平豐富、分離簡(jiǎn)單且有標(biāo)準(zhǔn)的操作程序，多次密度梯度離心去除血細(xì)胞即可收集血小板，期間要注意血小板的活性和防止血小板凝集[13]。

2.2液態(tài)活檢的檢測(cè)技術(shù)

2.2.1ARMS-PCR ARMS-PCR是根據(jù)已知突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，當(dāng)患者基因片段存在突變時(shí)，該片段會(huì)被擴(kuò)增，同時(shí)阻滯野生型基因片段的擴(kuò)增反應(yīng)。該方法適用于檢測(cè)已知突變位點(diǎn)，方便快捷、靈敏度高、特異度高且應(yīng)用廣泛，此技術(shù)已被批準(zhǔn)用于檢測(cè)晚期NSCLC的EGFR突變，也是血液EGFR突變檢測(cè)專家共識(shí)推薦的技術(shù)。ARMS-PCR的升級(jí)技術(shù)--Super-ARMS的靈敏度可達(dá)0.2%，更加有利于已知突變位點(diǎn)的檢出[18]。

2.2.2數(shù)字PCR 區(qū)別于普通PCR的相對(duì)定量，dPCR是對(duì)DNA分子的絕對(duì)定量。dPCR技術(shù)主要包括微滴數(shù)字PCR(ddPCR)、BEAMing技術(shù)以及QuantStudio 3D dPCR。ddPCR是將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成上萬個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴不含或含一個(gè)待檢核酸靶分子，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度[18]；BEAMing技術(shù)結(jié)合了dPCR以及流式技術(shù)，每一種DNA分子都會(huì)與專一的磁珠相連接并擴(kuò)增，然后DNA分子之間的差異通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)；基于芯片技術(shù)的QuantStudio 3D dPCR可對(duì)RNA進(jìn)行絕對(duì)定量[19]。dPCR的靈敏度可達(dá)0.1%～0.0001%，實(shí)現(xiàn)了分子的絕對(duì)定量，準(zhǔn)確度高且易于掌握，在動(dòng)態(tài)分析個(gè)體突變、檢測(cè)稀有突變、量化特定的核酸種類等方面具有重要價(jià)值。

2.2.3NGS NGS是將待測(cè)基因打斷成若干DNA片段，然后兩端加上接頭，進(jìn)行擴(kuò)增的同時(shí)檢測(cè)信號(hào)的高通量測(cè)序技術(shù)，此技術(shù)大體分為建庫、高通量平行測(cè)序和生物信息學(xué)分析3大部分。NGS可同時(shí)對(duì)數(shù)百萬個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，隨后進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)已知或未知的基因變異，具有高通量、靈敏度高、可發(fā)現(xiàn)新的未知突變位點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)。隨著技術(shù)的發(fā)展，基于NGS及PCR技術(shù)的標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序、癌癥個(gè)體化深度測(cè)序分析，不僅可以檢測(cè)點(diǎn)突變、插入、缺失或重排，還可以檢測(cè)拷貝數(shù)變異和基因融合[20]。

3 液態(tài)活檢在肺癌中的臨床應(yīng)用

3.1早期篩查與輔助診斷 ILIE等[21]發(fā)現(xiàn)對(duì)于肺癌的高風(fēng)險(xiǎn)人群來說，可在CT掃描未檢測(cè)到結(jié)節(jié)前，通過對(duì)CTC的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定和檢測(cè)其上皮-間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，可以提前預(yù)測(cè)肺癌的發(fā)生；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在這些高風(fēng)險(xiǎn)患者中檢測(cè)到的CTC的表型與其組織腫瘤表型相似。由此可見，CTC在肺癌的早期篩查中扮演了一定的角色。PHALLEN等[22]利用靶向錯(cuò)誤校正測(cè)序(TEC-Seq)的方法對(duì)44例健康個(gè)體和200例肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌以及卵巢癌患者的cfDNA進(jìn)行分析評(píng)估，分別檢測(cè)到Ⅰ期或Ⅱ期患者的血漿中的體細(xì)胞突變的概率為59%、71%、59%、68%，而且術(shù)前較高水平的cfDNA與腫瘤的復(fù)發(fā)相關(guān)；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)基于ctDNA的超深度測(cè)序分析NSCLC的6個(gè)不同基因中的568個(gè)突變，靈敏度和分析特異度分別為90.5%和100.0%，這為輔助臨床診斷提供了有力的支持。

3.2指導(dǎo)臨床靶向用藥 利用液態(tài)活檢技術(shù)對(duì)腫瘤基因組進(jìn)行分析，結(jié)合患者具體情況，可指導(dǎo)臨床用藥。在無法進(jìn)行組織活檢的情況下，HU等[23]通過分析225例晚期NSCLC患者的CTC中EGFR突變情況以指導(dǎo)臨床用藥；也有研究表明可以利用CTC中間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因重排情況來指導(dǎo)克唑替尼的使用，以促進(jìn)個(gè)體化治療[24]；研究者同時(shí)檢測(cè)組織DNA和ctDNA中的EGFR突變情況發(fā)現(xiàn)兩者具有很高的一致性，基于ctDNA檢測(cè)的EGFR突變情況可以指導(dǎo)晚期NSCLC患者采用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療[25]。在對(duì)外泌體的研究過程中發(fā)現(xiàn)可以利用外泌體DNA進(jìn)行EGFR分子分型和EGFR T790M分析，其結(jié)果與組織分子分型的結(jié)果具有很高的一致性，而且聯(lián)合檢測(cè)外泌體中的DNA/RNA和ctDNA可以提高檢測(cè)EGFR的靈敏度和特異度，為患者選擇正確的靶向藥物提供強(qiáng)有力的依據(jù)[26]。除此之外，關(guān)于TEPs的研究發(fā)現(xiàn)憑借RNA測(cè)序分析腫瘤(NSCLC、胰腺癌、乳腺癌等)患者血小板信息，鑒別出癌癥亞型的正確率為71%，且能夠正確識(shí)別突變基因EGFR、KRAS、PIK3CA，對(duì)臨床用藥具有指導(dǎo)意義[27]。

3.3實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物療效 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)腫瘤狀態(tài)，能夠準(zhǔn)確把握疾病的發(fā)展?fàn)顩r，提高治療效果，延長肺癌患者的生存期，改善生活質(zhì)量。有研究者對(duì)EGFR-TKI繼發(fā)耐藥患者的CTC進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)約有80%的患者能夠檢出與組織活檢相同的T790M突變[28]；同樣對(duì)使用EGFR-TKI藥物的NSCLC患者的ctDNA進(jìn)行檢測(cè)，有47%(55/117)的患者發(fā)生了EGFR T790M突變，結(jié)果提示臨床及時(shí)調(diào)整用藥，以延長患者總生存期[29]；而且NEWMAN等[30]對(duì)NSCLC患者ctDNA的分子特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在插入、缺失、點(diǎn)突變以及ALK重排等改變，并證明與影像學(xué)相比，ctDNA的分析可以更好地評(píng)估患者早期對(duì)治療的反應(yīng)，并可用于區(qū)分殘留病變和治療相關(guān)改變。最近的一項(xiàng)研究利用等位基因特異性PCR的方法分析NSCLC患者的外泌體RNA/DNA中的EGFR T790M突變，靈敏度為92%，特異度為89%，可見外泌體在耐藥性分析方面的潛力巨大[31]。除此之外，關(guān)于TEPs的研究表明TEP具有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的潛力，可以比影像學(xué)檢查更早地提示疾病的進(jìn)展[13]。

3.4預(yù)后評(píng)估分析 CTC和ctDNA代表的腫瘤分子信息以及它們的水平變化在一定程度上可以反映患者的無進(jìn)展生存期[32]；此外，在對(duì)外泌體的分析中發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-21-5p的表達(dá)上調(diào)預(yù)示著NSCLC患者有更差的預(yù)后[33]；同樣在對(duì)接受克唑替尼藥物治療的肺癌患者的血小板進(jìn)行RNA分析時(shí)，檢測(cè)出EML-ALK+的患者無進(jìn)展生存期為3.4個(gè)月，EML-ALK-的患者無進(jìn)展生存期為16個(gè)月[34]。

4 小 結(jié)

液態(tài)活檢憑借其非侵入性、能較好地克服腫瘤異質(zhì)性、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤信息等優(yōu)勢(shì)，尤其是在無法獲取組織標(biāo)本的情況下，為肺癌的早篩、診斷和治療開辟了新道路。盡管目前還存在一些問題，如靈敏度與特異度更高的分離檢測(cè)方法仍需要臨床驗(yàn)證以推進(jìn)液態(tài)活檢在肺癌診療中的應(yīng)用，尚未建立標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的樣本采集、處理、分析程序，從研究到臨床轉(zhuǎn)化還需更充分的證據(jù)支持，但它在肺癌診療中的潛力是不可忽視的[35]。通過更先進(jìn)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法來增強(qiáng)其可信度和可實(shí)踐性，液體活檢將會(huì)獲得重大的進(jìn)展并廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。未來液體活檢技術(shù)必將在肺癌的早期診斷、靶向用藥、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)價(jià)等方面發(fā)揮更大價(jià)值。