外泌體在肺癌發(fā)病機制及診療中的研究進展

周斯悅 綜述,段 勇 審校

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科/云南省檢驗醫(yī)學重點實驗室/云南省實驗診斷研究所,云南昆明 650032)

外泌體是一種具有脂質雙層膜結構的球型納米級胞外囊泡，直徑50～100 nm[1]，最早由JOHNSTONE等[2]在研究綿羊網織紅細胞成熟過程中發(fā)現,由細胞膜內陷后通過一系列復雜機制生成的多胞體(MVBs)釋放到細胞外環(huán)境中[3]。外泌體的形成與細胞分泌有關，受多種蛋白質調節(jié)，如Rab蛋白(Rab27A / B)、熱休克蛋白70(HSP70)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、ALG-2相互作用蛋白X(Alix)和四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)[4]。在正?；虿±項l件下，幾乎所有類型的細胞都可分泌外泌體，如網織紅細胞、免疫細胞、上皮細胞，但腫瘤細胞能分泌更多的外泌體。外泌體含有多種生物活性分子，包括蛋白質、核酸、脂質，在許多病理及生理過程中發(fā)揮重要作用，并且能將信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能，是細胞間信息傳遞的重要方式[5]。外泌體天然存在于體液中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、膽汁、羊水、腹水及腦脊液等。

肺癌是世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，可分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)，前者占80%，具有易轉移復發(fā)、惡性程度高的特點。我國是肺癌高發(fā)國，2015年中國分地區(qū)腫瘤和死亡分析顯示，我國東、中、西部常見惡性腫瘤中肺癌均排名首位，也是腫瘤死亡的常見原因[6]。2012年肺癌在男性以及欠發(fā)達國家的腫瘤相關死亡原因中居首位，盡管針對肺癌診療的研究已經取得較大進展，但肺癌預后情況仍不理想，5年生存率并未明顯改善。主要原因是腫瘤得不到早期診斷，會發(fā)生早期轉移[7]。因此，迫切需要發(fā)掘有助于肺癌早期診斷的新型標志物。研究發(fā)現，外泌體參與調節(jié)腫瘤發(fā)生的多個過程，包括促進腫瘤血管形成、調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫應答、上皮間質轉化、促進腫瘤細胞侵襲與轉移等。近年來，外泌體的研究特別是在腫瘤領域的研究是一個熱點。筆者就近年來外泌體在肺癌發(fā)病機制及診療中的研究進展進行綜述，展望該領域的發(fā)展前景。

1 外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展、轉移中的作用

1.1外泌體促進腫瘤血管生成 腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有著關鍵作用，學者們已經證實外泌體可促進腫瘤血管生成。LIU等[8]的研究表明，外泌體中的miR-21可以激活STAT3，從而增加血管內皮生長因子受體(VEGF)的表達，最終誘導人支氣管上皮細胞的血管生成和惡性轉化。CUI 等[9]研究表明過表達基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)通過激活CD63/PI3K/AKT/HIF-1通路促進來源于肺腺癌、包含miR-210的外泌體分泌，并最終證實其在體外實驗中刺激腫瘤血管生成。HSU等[10]發(fā)現了外泌體中的miR-23a 在低氧和正常氧條件下都可促進腫瘤血管生成，從而表明缺氧腫瘤癌細胞和遠離腫瘤的正常氧環(huán)境中的內皮細胞之間可以傳遞遺傳物質。ZHUANG等[11]的研究證明通過激活JAK-STAT信號通路，外泌體中miR-9可以促進血管生成。這些結果表明肺癌來源的外泌體促進血管生成，從而可能導致癌癥的發(fā)生和發(fā)展。

1.2外泌體可調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫應答 外泌體有調節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫應答的能力，從樹突狀細胞(DC)釋放的外泌體可攜帶腫瘤抗原，激活免疫應答。GUO等[12]的研究團隊發(fā)現來源于DC細胞的外泌體與抗癌藥物環(huán)磷酰胺(CTX)、具有促DC細胞成熟作用的干擾素誘導劑聚肌胞苷酸(poly I:C)聯合使用能在體內和體外實驗中增強抗腫瘤活性。FABBRI等[13]研究表明，來自肺癌細胞的外泌體miR-21 、 miR-29a可以作為Toll樣受體(TLR)的配體，最終導致腫瘤生長和轉移。因此，作為TLR的旁分泌激動劑，外泌體miRNA可以調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫應答。此外，活化的表達FasL的CD8+T細胞分泌的外泌體可激活ERK和NF-κB通路，導致MMP-9表達增加從而促進肺癌轉移[14]。

1.3外泌體促進上皮-間充質轉化(EMT) EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，它賦予細胞轉移和入侵的能力，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。RAHMAN等[15]研究表明，來源于高轉移性肺癌細胞和晚期肺癌患者血清的外泌體能夠誘導人支氣管上皮細胞(HBECs)中的波形蛋白表達和EMT。KIM等[16]研究了EMT中涉及的外泌體內容物的變化。在A549人肺腺癌細胞系中，外泌體的蛋白質含量(β-鈣黏蛋白)反映了細胞表型的變化，miR-23a表達也顯著增加。

1.4外泌體在肺癌轉移中的作用 WANG等[17]的研究發(fā)現，與NSCLC NCI-H2228細胞相比，在SCLC NCI-H1688細胞中觀察到外泌體中TGF-β和IL-10水平升高，在低氧條件下更甚。也發(fā)現肺癌細胞分泌的外泌體內TGF-β和IL-10表達升高與肺癌轉移相關。免疫檢查點蛋白是指在免疫系統中存在的一系列抑制信號的分子，含有T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域的分子3(Tim-3)是新一代免疫檢查點蛋白，可被其配體Galectin-9激活，從而負向調節(jié)抗腫瘤免疫應答。GAO[18]等學者研究發(fā)現患者血漿內的Galectin-9高表達水平與腫瘤轉移相關。HOSHINO等[19]的研究表明，外泌體整合素α6β4和α6β1與肺癌轉移相關。ZHANG等[20]的一項研究顯示，與健康人相比，NSCLC患者中外泌體lncRNA MALAT-1高表達。 此外，外泌體MALAT-1高表達與晚期腫瘤分期和淋巴轉移相關。這些機制都可成為腫瘤治療的潛在靶點。

2 外泌體在肺癌診斷、評估預后中的作用

外泌體可作為診斷肺癌及評估預后的新型生物標志物。首先，外泌體可反映其親代細胞的生理狀態(tài)和微環(huán)境，并且大多數細胞分泌的外泌體含有特定蛋白質、核酸等。其次，外泌體存在于血液和其他體液中，分布廣泛。由于具有磷脂雙分子層，外泌體在細胞外環(huán)境中非常穩(wěn)定。至今為止，已經報道了許多來源于外泌體的miRNA、lncRNA以及蛋白質等可作為肺癌潛在的診斷、預后生物標志物。

2.1外泌體miRNA ZHOU等[21]檢測了6種肺腺癌患者外周血中提取的外泌體miRNA(miR-19b-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-409-3p、miR-425-5p和miR-584-5p)。其中，miR-19-3p、miR-21-5p和miR-221-3p顯著上調。此外，LIN等[22]發(fā)現27種來源于肺炎和肺癌的胸腔積液外泌體中差異表達的miRNA。在這些miRNA中，miR-205-5p和miR-200b在肺癌樣本中顯著上調，表明這兩種miRNA可能具有鑒別肺癌和肺炎的潛力。上述研究中檢測的外泌體miRNA并未涉及肺癌的早期診斷，因為在這些研究中沒有選擇特定臨床階段的患者。在近期的一項研究中，JIN等[23]對46例Ⅰ期NSCLC患者和42例健康人對照組分離的外泌體進行miRNA-seq分析以鑒定NSCLC患者外泌體miRNA的早期診斷價值。發(fā)現了由4個miRNA：let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p和miR-486-5p組成的miRNA診斷小組，可用于診斷Ⅰ期NSCLC，受試者工作特征曲線(ROC)的曲線下面積(AUC)為0.899，靈敏度為80.25%，特異度為92.31%。該課題組還檢測了4種腺癌特異性外泌體miRNA，包括miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p，ROC AUC為0.936，靈敏度為80.65%，特異度為91.67%。檢測了3種鱗狀細胞癌特異性外泌體miRNA：miR-10b-5p、miR -15b-5p和miR-320b，ROC AUC為0.911，靈敏度為83.33%，特異度為90.32%。結果顯示，這兩個組合具有區(qū)分NSCLC患者腺癌或鱗癌的潛力，這一研究說明外泌體源性miRNA不僅可應用于肺癌分期，還可用于判斷肺癌分型。此外，GRIMOLIZZI等[24]學者的研究發(fā)現，miR-126在晚期患者的血漿中水平下調；還發(fā)現來源于細胞的外泌體miR-126能夠誘導正常人支氣管上皮細胞的惡性轉化，而相反，來源于人支氣管上皮細胞中的外泌體miR-126能夠抑制細胞生長且誘導惡性缺失。這表明外泌體miRNA在調節(jié)微環(huán)境中有重要作用，其作為診斷標志物在個性化治療領域有廣闊前景。

2.2外泌體蛋白質 外泌體中除了miRNA外，還存在多種蛋白質，外泌體蛋白質也可以作為診斷標志物。SANDFELD-PAULSEN等[25]研究了49種外泌體膜附著蛋白在336例肺癌患者和127例健康對照中的診斷潛力。發(fā)現CD151、CD171和tetraspanin 8是可以明顯區(qū)分肺癌患者和非肺癌患者的生物標志物。此外，研究者也使用276例NSCLC患者的血清樣本評估了49種蛋白質作為預后標志物的潛力。他們發(fā)現5種蛋白質(NY-ESO-1、EGFR、PLAP、EpCam和Alix)對預測肺癌患者長期生存率有效，可以作為肺癌潛在的預后標志物。除了血液，研究人員還發(fā)現了來自其他體液的外泌體蛋白：富含亮氨酸的α-2-糖蛋白(LRG1)與蛋白質相互作用、信號轉導、細胞黏附等過程密切相關，在NSCLC患者組尿液和組織外泌體中表達水平高于健康組。因此，除血清外，尿液外泌體也可能成為檢測肺癌的潛在標志物[26]。PARK等[27]從NSCLC患者的惡性胸腔積液中分離出高純度的外泌體，并發(fā)現了潛在的診斷標志物：EGFR、K-ras、basigin、癌胚抗原相關細胞黏附分子6、claudin1、claudin3和RAB家族蛋白。

2.3其余外泌體內含物 除了miRNA、蛋白質以外，外泌體中還含有其他分子，如長鏈非編碼RNA(lncRNAs)、環(huán)狀RNA(circRNA)。ZHANG等[20]的一項研究顯示，與健康人相比，NSCLC患者外泌體長鏈非編碼RNA(lncRNA) MALAT-1高表達。此外，LI等[28]的研究結果表明，環(huán)狀RNA(circRNA)在血清外泌體中含量多并且穩(wěn)定。外泌體血清circRNAs可以區(qū)分結腸癌患者和健康人。這些結果表明，外泌體circRNA、外泌體lncRNA有望成為診斷癌癥的生物標志物。

3 外泌體在肺癌治療中的作用

3.1外泌體作為藥物遞送載體 外泌體作為藥物遞送載體具有多個優(yōu)點，如外泌體的磷脂雙分子層可防止藥物在短時間內降解，具有穩(wěn)定性，并且利于外泌體與靶細胞膜直接融合；外泌體具有較低的免疫原性和毒性；外泌體由特定細胞釋放，可作為細胞間傳遞信號的載體。有研究已經報道外泌體可作為天然的藥物遞送載體：SRIVASTAVA等[29]研發(fā)了一種含有阿霉素的外泌體遞送系統，并證明了這一系統對H1299和A549肺癌細胞系具有抗癌活性。紫杉醇(PTX)是一種具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物，有研究者將巨噬細胞衍生的外泌體包裹紫杉醇制成外泌體制劑(exoPTX)，表面修飾氨基乙酰胺聚乙二醇(AA-PEG)?？赏ㄟ^受體介導的內吞作用在肺癌細胞中積累，其藥物水平高于運用非外泌體包裹的水平。即使用工程化的巨噬細胞外泌體進行靶向紫杉醇藥物遞送可增強肺癌轉移的治療效果[30]。但要使用外泌體作為藥物遞送載體尚存在一些問題，例如，如何在不破壞外泌體結構的條件下將藥物載入外泌體內；如何控制外泌體藥物的釋放，提高藥物傳遞效率等。

3.2外泌體改變藥物敏感性的作用 眾多研究團隊報道了耐藥性與多種因素相關，外泌體可能為潛在的機制。一些研究已經報道了外泌體對肺癌藥物[順鉑和表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)]和放射療法耐藥性的影響。LI等[31]發(fā)現來源于吉非替尼處理的細胞外泌體降低了順鉑的敏感性，而源自順鉑處理過的細胞的外泌體沒有改變吉非替尼的敏感性。如果加入GW4869(一種外泌體分泌抑制劑)，則可觀察到順鉑和吉非替尼具有協同作用。這些結果表明，抑制外泌體的分泌可以降低EGFR-TKIs與化療藥物之間的拮抗作用，提高藥物敏感性。另一項研究報道了外泌體內中間變性淋巴瘤激酶(ALK)對ALK抑制劑色瑞替尼(Ceritinib)敏感性的降低作用[32]，作者觀察到內含ALK外泌體的處理組能夠導致腫瘤細胞生長加快以及色瑞替尼敏感性降低，表明外泌體中ALK蛋白是促進腫瘤生長以及損害ALK抑制劑(色瑞替尼)對ALK陽性的非小細胞肺癌治療效果的關鍵因素。腫瘤耐藥受多種因素調控，外泌體由于包含核酸、蛋白等物質，在細胞間通訊中發(fā)揮重要作用，而腫瘤利用了這種通訊機制從而改變藥物的敏感性。

4 小 結

外泌體是內含核酸、蛋白質、脂質等的細胞外囊泡，在許多生理與病理過程中發(fā)揮重要作用，并且能將信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能，是細胞間信息傳遞的重要方式。越來越多的研究顯示其可以在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起促進作用，檢測外泌體內容物有助于肺癌的診斷、治療與預后評估。但有關外泌體如何形成、其發(fā)揮作用的功能機制以及靶分子和信號通路的研究尚未完全清楚。此外，目前有關外泌體檢測的分離、純化、定量等步驟尚沒有標準化方法，所以仍需對外泌體進行更加深入的探索，更好地闡明外泌體在肺癌中的作用機制，利用外泌體研發(fā)出更多有效的治療、診斷方法，為肺癌的診斷、治療提供新思路。