持續(xù)性根尖周炎根管內(nèi)外生物膜特性的研究進(jìn)展

楊子 侯本祥

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 北京 100050

持續(xù)性根尖周炎（persistent apical periodontitis，PAP）又稱為難治性根尖周炎（refractory apical periodontitis），是指通過反復(fù)的根管治療，竇道仍不愈或根尖周病變持續(xù)存在的慢性根尖周炎[1]。

研究[2]表明，PAP與根管內(nèi)外存在的微生物的定植和感染有關(guān)。根外生物膜附著于根尖區(qū)牙骨質(zhì)或超填的牙膠尖表面，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其來源于根管內(nèi)生物膜，但其是否仍依賴于根內(nèi)感染存在目前仍不確定，本文從PAP與生物膜的關(guān)系、根管內(nèi)外生物膜細(xì)菌組成的異同及其依存關(guān)系等方面對PAP的病因進(jìn)行進(jìn)一步探討。

1 PAP與生物膜的關(guān)系

形態(tài)學(xué)及組織學(xué)研究顯示，PAP根管內(nèi)外均存在細(xì)菌生物膜，但根管內(nèi)外細(xì)菌生物膜組成有所不同，根管內(nèi)生物膜以絲狀和分支狀細(xì)菌為主導(dǎo)。

Nair等[3]通過光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡對6例PAP患牙根尖進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)根管內(nèi)有生物膜覆蓋，其內(nèi)有大量的革蘭陽性的絲狀及分支狀細(xì)菌。Carr等[4]通過根尖手術(shù)獲取非手術(shù)再治療失敗患牙根尖組織，透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)根管內(nèi)大量生物膜結(jié)構(gòu)，幾乎所有的細(xì)菌都被包裹在由不同變性階段的細(xì)菌組成的多層的厚的細(xì)胞外基質(zhì)中，其中可見凋亡細(xì)胞、影細(xì)胞以及分裂細(xì)胞。

根外生物膜既可由單一菌種構(gòu)成，也可由多菌種共同組成，以球菌、桿菌和絲狀菌為主，也可見到螺旋體及真菌存在。Wang等[5]和Sousa等[6]分別對35例及20例PAP患牙根尖外表面進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，均檢出根外生物膜的存在，其內(nèi)含有大量棒狀菌和絲狀菌。

Su等[7]在掃描電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，PAP患牙接近根尖孔牙根表面緊密堆積有微生物和細(xì)胞外基質(zhì)，在纖維束和細(xì)胞之間的不規(guī)則表面以及隱窩和孔中可觀察到細(xì)菌斑塊，細(xì)菌形態(tài)類型以球菌和桿菌為主。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)PAP患牙菌根尖外表面均有生物膜，具有球狀、絲狀、芽胞桿菌、桿菌的形態(tài)學(xué)多樣性。Ferreria等[9]在難治性根尖周炎患牙根尖生物膜中觀察到真菌的存在。

2 根管內(nèi)外生物膜細(xì)菌構(gòu)成的區(qū)別

微生物群落分析通常采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法，但影響培養(yǎng)的因素很多，隨著分子生物學(xué)方法的進(jìn)步，例如，擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物的指紋圖譜、棋盤雜交、定量PCR等方法廣泛應(yīng)用，可以檢出更多無法培養(yǎng)的微生物。

如今高通量方法也逐步開始應(yīng)用于口腔內(nèi)微生物的檢測，包括微陣列、下一代測序技術(shù)、宏基因組學(xué)等方法。

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)法檢測出的細(xì)菌種類

使用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法通常會遺漏難以培養(yǎng)的細(xì)菌，從而低估與持續(xù)性疾病相關(guān)細(xì)菌群落的多樣性。大量研究采用細(xì)菌培養(yǎng)的方法顯示，PAP根管內(nèi)生物膜僅能檢測到一種或幾種菌種，由厭氧菌主導(dǎo)，革蘭陽性菌比例較高，其中糞腸球菌最常見。

?ysakowska等[10]對28例持續(xù)性根尖周病變的患牙進(jìn)行再治療，在根管內(nèi)檢測出微生物以鏈球菌、腸球菌、丙酸桿菌屬、放線菌屬及乳桿菌屬為主。

根外細(xì)菌生物膜采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法可見多種細(xì)菌混合感染，以厭氧菌為主導(dǎo)。Tronstad等[11]對8個無癥狀PAP患牙的根尖周軟組織病變和根尖表面微生物進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)的細(xì)菌以厭氧菌為主，包括產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌、表皮葡萄球菌、放線菌屬、兼性鏈球菌屬及革蘭陽性厭氧桿菌和球菌等。

2.2 非培養(yǎng)方法

近年來，用分子生物學(xué)方法檢測微生物的多樣性，對尚不能進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行檢測鑒定，根內(nèi)、外生物膜的細(xì)菌組成發(fā)現(xiàn)，根管內(nèi)生物膜腸球菌、鏈球菌及梭桿菌檢出率較高，其中糞腸球菌最為常見[1]，并檢測出許多難以培養(yǎng)的細(xì)菌，例如D. invisus[12-13]、Synergistes clone BA121[14-15]等，具體見表1。

根外生物膜以放線菌屬、丙酸桿菌屬、梭桿菌檢出率較高，具體見表2。

表1 PAP根管生物膜優(yōu)勢菌檢出各研究比較Tab 1 Bacterial respective genera and species commonly found in the root canal associated with PAP

續(xù)表1

表2 PAP根尖生物膜優(yōu)勢菌的檢出比較Tab 2 Bacterial respective genera and species commonly found in extraradicular biofilm associated with PAP

2.3 高通量方法

非培養(yǎng)方法通過分析單一的病原體及病原體的分布及其與根尖周疾病之間的關(guān)系，從而提高對PAP根尖微生物群的了解。采用高通量的方法對根管內(nèi)生物膜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門的檢出率較高，但對根外生物膜采用高通量方法進(jìn)行群落分析的研究較少。Siqueira等[23]對10例PAP患牙的根尖進(jìn)行冷凍研磨提取根管系統(tǒng)內(nèi)微生物，采用Illumina測序方法進(jìn)行群落分析，發(fā)現(xiàn)超過85%的序列屬于變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和放線菌門，其中變形菌門的檢出率最高。Ping等[24]通過根尖手術(shù)收集了20例PAP患牙的根尖部分，將根尖樣品進(jìn)行低溫研磨進(jìn)行454-焦磷酸測序分析，其中厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門、互養(yǎng)菌門和螺旋體門均為最具代表性的門。Hong等[25]及Keskin等[26]通過高通量焦磷酸測序的方法發(fā)現(xiàn)持續(xù)性感染的根管內(nèi)與初次感染的根管內(nèi)細(xì)菌種類無明顯差異，但Tzanetakis等[27]的研究認(rèn)為相比于初次感染，持續(xù)性感染根管內(nèi)變形菌門及柔膜菌門顯著增多。

目前提出許多可以提供關(guān)于群落生理和功能的寶貴信息的方法，例如宏基因組學(xué)（直接從環(huán)境/中獲得的DNA的全基因組分析），轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA表達(dá)分析），蛋白質(zhì)組學(xué)（大規(guī)模蛋白質(zhì)表達(dá)分析）和代謝組學(xué)（代謝物剖面分析），已經(jīng)開始應(yīng)用于牙髓病學(xué)研究，Provenzano等[28]對10例PAP患牙行根尖手術(shù)，根尖周肉芽組織及根尖冷凍研磨后均進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)一些與致病性相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括與抗藥性，蛋白水解功能，黏附和毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)，且與腸球菌種、放線菌種、痤瘡丙酸桿菌、鏈球菌、普雷沃氏菌等細(xì)菌有關(guān)。這些方法有可能公開與臨床癥狀相關(guān)的分子模式，從而可能起到預(yù)測結(jié)果的作用。

3 根管內(nèi)生物膜與根外生物膜的依存關(guān)系

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為根外生物膜來源于根管內(nèi)生物膜，根管內(nèi)細(xì)菌可能通過根尖孔、側(cè)支根管或通過根表面牙骨質(zhì)被吸收的區(qū)域中的牙本質(zhì)小管到達(dá)根尖周組織，從而形成根外表面生物膜。其次在根管治療過程中，根管內(nèi)細(xì)菌也可能被推入根尖周圍組織。

此外，Kishen[29]通過對根尖部液體運(yùn)動分析測量證明，咬合可能導(dǎo)致細(xì)菌從根管內(nèi)轉(zhuǎn)移到根尖周組織。但根外生物膜是否依賴于根內(nèi)生物膜存在至今仍存疑，已有大量研究對不同牙齒的根管內(nèi)外的細(xì)菌組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其檢出種類及檢出率等均有所區(qū)別，但對同一患牙根管內(nèi)外生物膜的比較研究較少。

3.1 同一患牙根管內(nèi)外生物膜形態(tài)學(xué)分析

Tronstad等[30]對PAP患牙的根尖進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)根尖外表面處的細(xì)菌嵌入根尖孔外無結(jié)構(gòu)組織中，推測其來源于根管；根尖側(cè)方的細(xì)菌生物膜通常在軟組織覆蓋的隱窩或孔的內(nèi)部或周圍存在，間接表明這些區(qū)域的微生物也可能來自根管內(nèi)。一些研究[31-33]通過對PAP患牙根尖部進(jìn)行組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)根外生物膜與根管生物膜相鄰，支持根外生物膜是根管生物膜的延伸這一假設(shè)。但也有1例病例報(bào)道[31]對持續(xù)性低密度影的患牙進(jìn)行根尖手術(shù)，病理報(bào)道為根尖周囊腫，囊內(nèi)可檢測出放線菌，但根管系統(tǒng)內(nèi)無明顯感染，此病例提示在某些特殊情況在獨(dú)立于根管內(nèi)感染的根外感染可能是引起持續(xù)性病變的原因。

3.2 同一患牙根管內(nèi)外細(xì)菌構(gòu)成的異同

對同一患牙的根管內(nèi)外樣本進(jìn)行取樣進(jìn)行細(xì)菌群落分析的研究較少，Noguchi等[21]對PAP患牙研究發(fā)現(xiàn)，根外生物膜內(nèi)檢測到的細(xì)菌從同一牙齒的根管中的檢出率為86.7%，從而認(rèn)為殘留在根管中或從瘺管侵入的細(xì)菌可能成為根外生物膜的主要來源。Kuremoto等[34]采用單純髓腔開放法建立大鼠根外生物膜模型，通過實(shí)時(shí)PCR對根管內(nèi)外生物膜進(jìn)行分析，在根管及根尖外表面檢測出了相似的細(xì)菌物種，認(rèn)為根管內(nèi)細(xì)菌進(jìn)一步發(fā)展形成根外生物膜，根管內(nèi)生物膜的殘留細(xì)菌增加根外生物膜形成的可能。

4 PAP感染控制的方法

根管治療及再治療后仍然不成功是根尖手術(shù)的適應(yīng)證，通過切除患牙根尖1/3、倒預(yù)備及倒充填的方法去除根尖部的感染[35]，研究[36]發(fā)現(xiàn)PAP患牙采用根尖手術(shù)的方法具有良好的長期預(yù)后。Wang等[37]對81名患者進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究，顯微根尖手術(shù)后12～30月進(jìn)行復(fù)查，愈合率達(dá)到90.5%。根管再治療配合根尖手術(shù)是目前最值得推薦的方法。