精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸多肽層層自組裝修飾鈦片對小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的影響

劉菲 張云濤 馬向瑞 張雅杰 王云浩 .濱州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 濱州 56600；

2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科 濱州 256600；

3.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科 濱州 256600

鈦及鈦合金被廣泛應(yīng)用于口腔種植治療中，通過表面改性提高鈦及鈦合金種植體與骨的結(jié)合，是目前研究的熱點。生物化修飾種植體可使種植體表面具有生物活性，使之形成與天然骨相似的結(jié)構(gòu)與組成，從而調(diào)控細(xì)胞行為，可促進(jìn)種植體與骨結(jié)合，增強骨結(jié)合強度，從而縮短種植體早期負(fù)載的時間。

精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（arginyl-glycylaspartate，RGD）多肽是細(xì)胞膜整合素的特異性配體，與相應(yīng)細(xì)胞膜上的整合素亞基識別并與之結(jié)合，從而形成特異性的黏附，同時可激活相關(guān)基因，促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、分化及相關(guān)基因的表達(dá)[1]。

本實驗采用層層自組裝技術(shù)，用RGD多肽修飾純鈦表面，可使帶有相反電荷的不同電解質(zhì)在材料表面相互交替吸附、沉積，從而在鈦片表面形成具有特定厚度的多層自組裝多肽復(fù)合薄膜[2]，在復(fù)合薄膜表面進(jìn)行成骨細(xì)胞培養(yǎng)，檢測細(xì)胞的黏附、增殖以及骨鈣素和骨保護(hù)素的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗鈦片 1）TA4鈦片（成都海利華生物科技有限公司），直徑15 mm，厚1 mm，粗糙度為（0.20±0.02）μm。丙酮、75%乙醇、純水中超聲清洗各15 min，60 ℃干燥。2）NaOH處理鈦片，將清潔后干燥試件浸沒在5 mol·L-1NaOH溶液中60℃水浴24h，在80℃去離子水中保溫24h，60 ℃干燥備用。

1.1.2 RGD多肽涂層的制備 將NaOH處理后的鈦片浸入2.5 mg·mL-1聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI；Sigma公司，美國）水溶液中30 min，去離子水沖洗20 min；干燥后浸入含0.2 mg·mL-1RGD多肽的0.4 mg·mL-1NaHCO3溶液8h，去離子水沖洗20 min，60 ℃干燥；再將樣本浸入2.5%戊二醛30 min，去離子水沖洗30 min，60 ℃干燥。重復(fù)上述過程10個循環(huán)，形成多層RGD多肽覆蓋層[3]。

1.1.3 主要材料 小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫），α-Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基（α-minium Eagle's medium，α-MEM；Hyclone公司，美國），胎牛血清（浙江天杭生物科技公司），青霉素/鏈霉素溶液（Hyclone公司，美國），2.5 g·L-1胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）， 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT；Sigma公司，美國]，二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO；Amresco公司，美國），Trizol試劑（北京Takara公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser；TaKaRa公司，日本）、SYBR GreenMasterMix（TaKaRa公司，日本）。

1.1.4 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國），超凈工作臺，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM；EVO LS15；Zeiss公司，德國），全自動多功能酶標(biāo)儀（Thermo lab systems multiskan mk3，美國），熒光實時定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR；Rotor-Gene3000；Corbett公司，澳大利亞）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 以無鈦片為對照組，分別以未做表面處理的純鈦（pure titanium，PT）、NaOH處理后鈦片（NaOH-treated titanium，NT）和RGD多肽涂層鈦片（RGD-modified titanium，RT）為實驗組，共分4組。

1.2.2 材料表面微觀形貌觀察 用SEM在20 kV、放大5 000倍條件下觀察各組鈦片表面微觀形貌。

1.2.3 細(xì)胞體外培養(yǎng) 小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d換液1次，培養(yǎng)液為α-MEM（含10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素）。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底后，按1：3傳代，傳代3次后用于實驗。

1.2.4 細(xì)胞黏附檢測 將3組鈦片置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，無鈦片放置的孔為對照組，每組8個樣本。每孔用1 mL的75%乙醇浸泡30 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗3遍，吸出液體。將細(xì)胞以2×104mL-1接種于各組孔內(nèi)（每孔1 mL），分別在1、4、12、24 h時間點，采用MTT法在490 nm波長處測定各孔吸光度值。

1.2.5 SEM觀察細(xì)胞的黏附形態(tài) 將小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1以2×104mL-1接種于各組孔內(nèi)（每孔1 mL），培養(yǎng)12 h，使用SEM在10 kV、放大1 000倍條件下觀察細(xì)胞的黏附形態(tài)。

1.2.6 細(xì)胞增殖檢測 將小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1以2×104mL-1接種于各組孔內(nèi)（每孔1 mL），每組8個樣本。培養(yǎng)1、3、5、7 d后，采用MTT法在490 nm波長處測定各孔吸光度值。

1.2.7 RT-qPCR檢測骨鈣素、骨保護(hù)素mRNA表達(dá)水平 將小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1以5×104mL-1接種于各組孔內(nèi)（每孔1 mL），每組6個樣本。待細(xì)胞生長覆蓋80%表面積，將培養(yǎng)液更換為成骨誘導(dǎo)液，分別在成骨誘導(dǎo)的7、14 d，用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。編碼作為內(nèi)參物的磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）與目標(biāo)物骨鈣素、骨保護(hù)素的基因的引物由上海生工生物工程公司合成。GAPDH上游：5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，下游：5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'；骨鈣素基因上游：5'-GGTAGTGAACAGACTCCGGC-3'，下游：5'-GGCGGTCTTCAAGCCATACT-3'；骨保護(hù)素基因上游：5'-CCACTCGAACCTCACCACAG-3'，下游：5'-TCGCTCGATTTGCAGGTCTT-3'。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s，1 次循環(huán)；PCR擴(kuò)增， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30s，45次循環(huán)。將對照組基因表達(dá)量定義為1，計算每組的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用SPSS 17.0對各組數(shù)據(jù)行單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SEM觀察

使用SEM觀察各組鈦片的表面情況（圖1）。打磨后的PT組鈦片，表面光滑，有均勻一致較清晰的劃痕結(jié)構(gòu)；NT組鈦片表面的劃痕結(jié)構(gòu)變得不明顯，出現(xiàn)更為細(xì)小的結(jié)構(gòu)，類似小微孔結(jié)構(gòu)；RT組鈦片表面結(jié)構(gòu)無明顯打磨后的痕跡，細(xì)小結(jié)構(gòu)更明顯，類似小凸起，似網(wǎng)狀鋪在表面。

圖1 鈦片的表面形態(tài) SEM × 5 000Fig 1 Surface topography of the titanium plates SEM × 5 000

2.2 細(xì)胞在不同鈦片表面的黏附情況

統(tǒng)計結(jié)果（表1）顯示，RT組鈦片小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的黏附情況明顯好于其余3組。NT組細(xì)胞的黏附率情況則較差。

2.3 SEM觀察細(xì)胞在不同鈦片表面的黏附形態(tài)

使用SEM觀察小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的黏附情況（圖2），可見細(xì)胞貼壁生長。

PT組鈦片表面細(xì)胞呈扁平狀，多為多邊形，有少量偽足；NT組鈦片表面細(xì)胞伸展良好，呈扁平狀，形態(tài)各不相同，偽足較多；RT組鈦片表面細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形，伸展良好，大量絲狀偽足牢固附著或深入在材料表面。

表1 不同鈦片表面對小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1在不同時間點黏附的影響Tab 1 The effect of different titanium plates on the adhesion of MC3T3-E1

圖2 鈦片表面小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3的黏附形態(tài) SEM × 1 000Fig 2 Adhesion morphology of MC3T3 on surface of titanium plates SEM × 1 000

2.4 細(xì)胞在不同鈦片表面的增殖情況

小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1培養(yǎng)1和3 d，RT組細(xì)胞增殖率最高。在5和7 d時，RT組細(xì)胞的增殖情況與對照組、PT組無明顯差異；NT組細(xì)胞的增殖情況則最差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 不同鈦片表面對小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1骨鈣素、骨保護(hù)素mRNA表達(dá)的影響

采用RT-qPCR檢測培養(yǎng)7 d時的小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1，RT組細(xì)胞骨鈣素mRNA的表達(dá)水平與PT組和NT組細(xì)胞的表達(dá)水平之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)14 d時，與PT組相比，RT組和NT組細(xì)胞骨鈣素mRNA的水平明顯升高（P＜0.05）。骨保護(hù)素mRNA在培養(yǎng)7和14 d時的表達(dá)有相同的趨勢，RT組和NT組均明顯高于PT組（P＜0.05），其中RT組骨保護(hù)素mRNA的表達(dá)量也較NT組明顯上調(diào)（P＜0.05）。

表2 不同鈦片表面對小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1增殖的影響Tab 2 The effect of different titanium plates on the proliferation of MC3T3-E1

圖3 不同鈦片表面對小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1骨鈣素、骨保護(hù)素mRNA表達(dá)的影響Fig 3 mRNA expression of osteocalcin and osteoprotegerin in MC3T3-E1 on different titanium plates at different times

3 討論

RGD多肽是存在于細(xì)胞黏附蛋白中的短肽序列，細(xì)胞膜上的整合素亞基是介導(dǎo)細(xì)胞黏附的重要跨膜受體[3]。RGD多肽作為細(xì)胞黏附蛋白與相應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合位點，與被黏附細(xì)胞的細(xì)胞膜整合素亞基識別并結(jié)合，增強其與細(xì)胞間的黏附與增殖[4]。Hoyos-Nogués等[5]利用RGD多肽修飾材料，使材料表面具有生物活性及骨誘導(dǎo)作用，促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的附著和鋪展，從而促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖。在本研究中，RGD多肽修飾鈦片的表面與經(jīng)NaOH處理后的鈦表面相比，表面潤濕性提高，表面能降低，利于細(xì)胞的識別[6]。SEM觀察顯示，在RGD多肽涂層鈦片表面，培養(yǎng)12 h的小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1有大量絲狀偽足，鋪展充分，緊密附著在材料表面，這可能是因鈦片表面RGD多肽與細(xì)胞膜整合素亞基識別并與之結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞在鈦片表面更好鋪展。RGD多肽能促進(jìn)小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的早期增殖，細(xì)胞在培養(yǎng)1和3 d時，增殖情況明顯高于其他3組。Chen等[7]將RGD多肽化學(xué)固定于鈦片表面，培養(yǎng)小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1，發(fā)現(xiàn)3和5 d時細(xì)胞的增殖率均較未涂層鈦有所增加，其結(jié)果與本實驗結(jié)果一致。NT組鈦片表面的細(xì)胞增殖情況明顯低于對照組及PT組，這與之前的研究[8-9]不同，可能是由于鈦片處理的方式不同導(dǎo)致表面的粗糙度不同。

骨鈣素是成骨細(xì)胞分化后期的最具特征性的標(biāo)志物，是判斷其分化成骨能力的重要指標(biāo)[10]。后期骨鈣素mRNA水平上調(diào)，說明RGD多肽促進(jìn)了小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的分化成骨。骨保護(hù)素又被稱為骨保護(hù)蛋白，可以與核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）結(jié)合，從而競爭性地阻斷了破骨細(xì)胞與RANKL結(jié)合，抑制了破骨細(xì)胞的分化，降低了破骨細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡，對于防止骨質(zhì)吸收起到了調(diào)節(jié)作用[11]。骨保護(hù)素在成骨細(xì)胞中高表達(dá)，說明對骨吸收有抑制作用。在本實驗中，RT組鈦片可以使細(xì)胞分化后期的骨鈣素mRNA水平上調(diào)，促進(jìn)了細(xì)胞的成骨分化，同時還能通過上調(diào)骨保護(hù)素，從而抑制破骨細(xì)胞分化，減少骨的吸收。Chua等[12]通過自組裝技術(shù)在鈦表面添加RGD多肽并進(jìn)行細(xì)胞實驗，結(jié)果證明促進(jìn)了成骨細(xì)胞黏附性、增殖及細(xì)胞堿性磷酸酶活性。Raphel等[13]的研究也證實，鈦表面用RGD多肽修飾后有利于成骨細(xì)胞后期的分化。

種植體周圍骨質(zhì)形成的速度、骨結(jié)合強度和骨結(jié)合時間是種植體成功的關(guān)鍵。鈦在空氣中易形成氧化物薄膜，表面無法提供足夠的功能基團(tuán)來固定生物分子，需對其進(jìn)行處理。目前對種植體表面進(jìn)行多肽修飾的方法有物理吸附、化學(xué)固定及層層自組裝技術(shù)等。物理吸附通過非共價鍵吸附于材料表面，操作簡便，但其形成的RGD多肽覆蓋層厚薄不一，且與種植體表面結(jié)合穩(wěn)定性較差?；瘜W(xué)固定用酸或過氧化氫溶液作修飾試劑，獲得修飾材料的功能基團(tuán)，可其破壞種植體表面的原有形貌，影響種植體骨結(jié)合。層層自組裝技術(shù)中鈦片經(jīng)過NaOH處理會活化其表面，使之獲得大量帶有負(fù)電荷的羥基，有利于自組裝，可保證RGD多肽的數(shù)量和結(jié)合強度[14]。采用SEM觀測材料表面形貌，經(jīng)過NaOH處理的鈦片的表面劃痕結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)微孔結(jié)構(gòu)，而層層自組裝RGD多肽修飾的鈦片的表面出現(xiàn)了微小凸起結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可能與正負(fù)電荷交替吸附形成的RGD多肽涂層有關(guān)。

與物理吸附和化學(xué)固定方式相比，采用層層自組裝方式用RGD多肽修飾鈦片有其獨特的優(yōu)勢，可以不破壞材料表面的形態(tài)，可有效控制多肽厚度，且操作簡單。多肽層層自組裝的原理被認(rèn)為是多肽分子間非共價鍵的作用力，對自組裝原理的研究對于準(zhǔn)確預(yù)測和控制自組裝聚集體的結(jié)構(gòu)有著極為重要的作用。RGD多肽修飾鈦片能促進(jìn)小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的黏附和增殖，并且能夠上調(diào)骨鈣素和骨保護(hù)素mRNA的表達(dá)，從而能增強細(xì)胞的成骨能力，加快種植體骨結(jié)合，有利于早期種植體的穩(wěn)定性，提高種植體植入的成功率，其臨床應(yīng)用價值巨大。然而，多肽分子自組裝的設(shè)計不同，其形成的化學(xué)結(jié)構(gòu)也不盡相同。在本實驗中，多肽涂層的結(jié)構(gòu)并不完全明確，哪種結(jié)構(gòu)更加有利于細(xì)胞的黏附、生長及促進(jìn)成骨，以及在動物實驗中是否能達(dá)到早期愈合的效果，仍需進(jìn)一步研究，也是筆者后續(xù)研究的主要目標(biāo)。