CircRNA在女性生殖系統(tǒng)疾病中的研究進展

趙鴻娟，蔣元欣，王煜

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種閉合連續(xù)的環(huán)狀非編碼RNA，1976年首次在仙臺病毒中發(fā)現(xiàn)[1]。CircRNA一度被認為是RNA錯誤剪接或剪接過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，研究者認為其生物學(xué)功能不強，未對其有足夠的重視和研究[2]。后來，隨著高通量測序技術(shù)和生物信息技術(shù)的飛速發(fā)展，人們陸續(xù)在線蟲、果蠅、小鼠、大鼠、猴子、樹鼩和豬等動物身上也發(fā)現(xiàn)了circRNA的存在[3]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA具有組織特異性和高度穩(wěn)定性等特點[4]，女性生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展可能與circRNA的異常密切相關(guān)，circRNA可通過多種機制參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖和侵襲，circRNA可能在作為腫瘤標志物和監(jiān)測疾病預(yù)后中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

1 CircRNA的分子生物學(xué)研究

CircRNA是一類廣泛而多樣的內(nèi)源性RNA，自發(fā)現(xiàn)以來，研究者又陸續(xù)在多種動植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并命名，人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)大約2 400個circRNA分子。CircRNA通常由mRNA前體（pre-mRNA）反向剪接而成，長度從幾百到幾千bp不等。CircRNA按其來源可分為3類：外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA和外顯子-內(nèi)含子circRNA，其主要來源于外顯子編碼區(qū)。CircRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)無極性也無多聚腺苷酸（Poly A）尾，與線性RNA相比不易被RNA核糖核酸酶水解，故circRNA具有較高穩(wěn)定性。CircRNA受多種機制調(diào)控，其充當微小RNA（miRNA）海綿可競爭性結(jié)合miRNA受體，降低miRNA對靶基因的抑制作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達水平[5]；circRNA可與mRNA部分堿基配對，直接調(diào)控mRNA，也可通過特異的RNA-RNA途徑來調(diào)控轉(zhuǎn)錄；另外，circRNA可通過類似miRNA海綿的競爭性作用調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)的功能；circRNA還可參與翻譯過程。Abe等[6]研究證明，哺乳動物或人類細胞中的circRNA可以不依賴任何核糖體進入位點、Poly A尾或帽子結(jié)構(gòu)，以滾環(huán)式擴增，翻譯出足量的蛋白產(chǎn)物。

2 CircRNA的作用

由于circRNA具有組織和發(fā)育階段的特異性，越來越多的研究證實在子宮內(nèi)膜、卵巢和宮頸細胞中存在特異circRNA的表達。近期Vo等[7]研究系統(tǒng)分析了人類腫瘤相關(guān)circRNA的表達特征，利用外顯子捕獲測序體系分析超過2 000例不同組織來源的人類腫瘤標本的circRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)circRNA的表達量與所對應(yīng)的線性RNA產(chǎn)物的表達量并不完全對應(yīng)，并且腫瘤中circRNA的表達量普遍低于健康組織。CircRNA在女性生殖系統(tǒng)疾病的許多方面起著重要作用，包括調(diào)控細胞周期、細胞凋亡、血管形成及侵襲，circRNA的研究有助于臨床對于這類疾病的診斷和預(yù)后，有望作為腫瘤標志物及疾病預(yù)后指標指導(dǎo)臨床治療。

2.1 子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs） EMs是指因內(nèi)膜細胞種植到子宮腔以外的部位而導(dǎo)致的以痛經(jīng)和不孕為表現(xiàn)的一種婦科疾病，其發(fā)病機制不明。迄今為止，人們普遍認為異位病灶是在月經(jīng)期間子宮內(nèi)膜碎片逆行產(chǎn)生的，但并不是所有經(jīng)歷經(jīng)血逆行的女性均患有EMs，患者可能存在某些易感因素[8]。有證據(jù)表明，EMs在位內(nèi)膜的基因表達水平與正常子宮內(nèi)膜相比有明顯改變[9-10]。Shen等[11]采用微陣列技術(shù)對4對卵巢巧克力囊腫和子宮在位內(nèi)膜進行檢測，并對24對樣本進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測，發(fā)現(xiàn)262個上調(diào)的circRNA和291個下調(diào)的circRNA，它們與1225個miRNA相關(guān)元件結(jié)合。其中競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）網(wǎng)絡(luò)包括122個miRNA和137個mRNA，并涉及9個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些都可能與EMs的發(fā)病有關(guān)。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與正常子宮內(nèi)膜相比，異位子宮內(nèi)膜中存在88個差異表達的circRNA，其中11個表達上調(diào)、77個表達下調(diào)，揭示了卵巢EMs中circRNA表達模式以及相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的作用，發(fā)現(xiàn)circRNA在卵巢EMs的發(fā)病過程中可能起著關(guān)鍵作用，進一步驗證發(fā)現(xiàn)，表達上調(diào)的circ_0004712和circ_0002198可能成為診斷卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的新型生物標記物。

2.2 宮頸癌（cervical cancer，CC） CC是最常見的婦科惡性腫瘤，持續(xù)高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染是其發(fā)生和發(fā)展的重要因素。隨著HPV疫苗的推廣應(yīng)用，宮頸癌的一級預(yù)防已在一定程度上得到實現(xiàn)，其發(fā)病率和死亡率在許多發(fā)達國家得到有效控制。然而，雖然女性中存在較高的HPV感染率，但CC的發(fā)病率相對較低，提示CC中存在個體遺傳差異和其他重要影響因素。因此，探索CC的確切發(fā)病機制并找到全新的診斷標志物作為潛在的治療靶點至關(guān)重要。1996年Braun等[13]在宮頸癌HeLa細胞中發(fā)現(xiàn)了通過外顯子環(huán)化形成circRNA的剪接過程。circRNA-7可在HeLa細胞中穩(wěn)定的過表達，miR-671通過間接調(diào)控circRNA-7的表達進而調(diào)控miR-7的活性，而miR-7的靶基因下調(diào)可有效促進HeLa細胞凋亡[14]。Ma等[15]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-000284在宮頸癌細胞中顯著上調(diào)，促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲；構(gòu)建干擾RNA，下調(diào)circRNA-000284，可使細胞周期G0/G1期阻滯，從而抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲。另外，miR-506也與circRNA-000284相互作用，circRNA-000284可正向調(diào)控miR-506的靶基因snail-2的表達，miR-506模擬物或snail-2沉默載體的共表達可消除circRNA-000284的致癌效應(yīng)，抑制宮頸癌細胞的增殖及遷徙能力，有助于抑制其轉(zhuǎn)移，改善宮頸癌預(yù)后。hsa_circ_0023404可通過hsa_circ_0023404/miR-136/TFCP2/YAP軸影響宮頸癌的進展，并且其高表達可促進宮頸癌患者的病情進展[16]。Liu等[17]研究使用人circRNA微陣列篩選CC組織和配對的癌旁正常組織，結(jié)果顯示CC組織中circRNA8924顯著上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)circRNA8924可通過競爭性結(jié)合miR-518d-5p/519-5p家族間接調(diào)節(jié)候選基因色素框同源蛋白8（CBX8）的表達進而促進子宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。Wang等[18]對3例HPV16感染誘發(fā)的宮頸癌和對應(yīng)癌旁組織的全轉(zhuǎn)錄組進行分析，發(fā)現(xiàn)19種長鏈非編碼RNA（lncRNA）、99種circRNA、28種miRNA和304種mRNA差異表達，每個miRNA都靶向多個lncRNA和circRNA。2019年Yi等[19]對人宮頸鱗癌及腺癌組織circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_000596、hsa_circRNA_104315、hsa_circRNA_400068、hsa_circRNA_101958和hsa_circRNA_103519可能作為ceRNA在宮頸癌中發(fā)揮重要作用。hsa_circRNA_101996在宮頸癌組織表達水平較正常組織高，且其表達水平與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，高水平的hsa_circRNA_101996與宮頸癌患者預(yù)后不良有關(guān)，circRNA_101996基因的下調(diào)顯著抑制宮頸癌細胞的增殖、細胞周期、遷移和侵襲，circRNA_101996通過抑制miR-8075的表達激活TPX2表達，增加宮頸癌的增殖和侵襲[20]。以上研究都為宮頸癌發(fā)病機制與治療的研究提供了新思路。

2.3 卵巢惡性腫瘤 卵巢惡性腫瘤中以卵巢上皮性腫瘤最多見，其次是惡性生殖細胞腫瘤，其中卵巢上皮性腫瘤死亡率占各類婦科腫瘤的首位，由于卵巢深居盆腔，體積小，缺乏典型癥狀，難以早期發(fā)現(xiàn)。卵巢上皮癌患者手術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤局限于卵巢的僅占不足30%，大多數(shù)已擴散到盆腹腔器官。Ahmed等[21]通過對卵巢上皮癌ⅢC期原發(fā)灶、腹膜轉(zhuǎn)移灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進行RNA測序發(fā)現(xiàn)，卵巢惡性腫瘤中可檢測到上萬種circRNA表達，癌灶組織中circRNA的表達水平明顯高于腹膜轉(zhuǎn)移灶和受累的淋巴結(jié)，通過原位病灶與轉(zhuǎn)移瘤之間的比較，轉(zhuǎn)移瘤中腫瘤相關(guān)信號通路分子如核因子κB（NF-κB）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等所對應(yīng)的mRNA上調(diào)而circRNA下調(diào)，說明circRNA的低表達可能與卵巢癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。Bachmayr-Heyda等[22]研究發(fā)現(xiàn)，正常卵巢上皮細胞中circRNA水平普遍低于卵巢癌細胞，因為正常卵巢表皮細胞增殖速度快于卵巢癌細胞，導(dǎo)致其circRNA積累相對減少。Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0061140在卵巢癌細胞株中表達上調(diào)，敲除該基因后可通過海綿化miR-370抑制叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子M1（fork head box M1，F(xiàn)OXM1）的表達，抑制卵巢癌細胞在體內(nèi)和體外的增殖和遷移。此外，多種包含miR-24/let-7結(jié)合位點的circRNA在轉(zhuǎn)移瘤中呈上調(diào)趨勢，提示circRNA可能通過其環(huán)化過程競爭性抑制mRNA線形剪接或miRNA海綿作用，調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，從而影響卵巢癌轉(zhuǎn)移和侵襲[21]。

2.4 子宮內(nèi)膜癌 子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，常見于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性。目前子宮內(nèi)膜癌的病因和發(fā)病機制仍未明確。Bokhman[24]于1983年提出將子宮內(nèi)膜癌分為Ⅰ型和Ⅱ型并沿用至今。其中Ⅰ型為雌激素依賴型，多有子宮內(nèi)膜增生和雌孕激素受體陽性；Ⅱ型為非雌激素依賴型，其發(fā)病與雌激素?zé)o明確關(guān)系。分子生物學(xué)研究認為，Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌均伴有不同的基因突變。Chen等[25]研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌患者和正常女性之間circRNA有明顯的差異性表達，在子宮內(nèi)膜癌組織中circ-ZNF91可能作為miRNA海綿，抑制細胞中miRNA-23B和miRNA-122A2的表達。Xu等[26]對子宮內(nèi)膜癌患者的血清進行研究，證實子宮內(nèi)膜癌患者血清中外泌體濃度顯著高于健康女性，并發(fā)現(xiàn)其中209個circRNA表達上調(diào)、66個表達下調(diào)；另外，通過對RNA序列進行分析發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者血清中hsa_circ_0109046和has_circ_0002577表達明顯升高。

2.5 輔助生殖 輔助生殖過程中，胚胎移植是否成功與子宮內(nèi)膜及胚胎植入密切相關(guān)。Liu等[27]利用芯片分析6例反復(fù)植入失敗患者及正常婦女子宮內(nèi)膜組織的circRNA表達譜，共篩選出856個差異表達的circRNA，為胚胎植入失敗的診斷和臨床治療提供了新的候選因子。Zhang等[28]通過構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)探討ceRNA在山羊子宮內(nèi)膜容受性中的作用，發(fā)現(xiàn)circRNA-8073通過充當miRNA海綿來降低miR-181a的表達水平，間接增加了子宮內(nèi)膜上皮細胞中神經(jīng)緊張素的表達，神經(jīng)緊張素通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路上調(diào)B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）/Bax表達，抑制子宮內(nèi)膜上皮細胞凋亡，并誘導(dǎo)白血病抑制因子、環(huán)氧合酶2、血管內(nèi)皮生長因子A等表達增加。因此，circRNA-8073可作為一種ceRNA發(fā)揮作用，抑制miR-181a表達，從而保護子宮內(nèi)膜上皮細胞免受miR-181a介導(dǎo)的抑制作用。與胚胎植入前相比，早期妊娠小鼠子宮內(nèi)膜中有101個上調(diào)的circRNA和75個下調(diào)的circRNA，構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA負相關(guān)網(wǎng)絡(luò)后，可下調(diào)21個circRNA和79個mRNA，上調(diào)14個miRNA[29]。

Tao等[30]檢測了13 950個circRNA在山羊排卵前卵泡中的表達情況，分析顯示麻城黑山羊與波爾山羊中有37個circRNA差異表達，circ-0008219參與了circRNA-miRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)circ-0008219可通過miRNA海綿作用于3個卵泡相關(guān)的miRNA，提示circRNA在母羊卵泡中具有潛在作用，可能與卵巢卵泡發(fā)育有關(guān)。Wang等[31]對多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者卵泡液外泌體中16 771個候選circRNA進行高通量測序分析，相對于正常女性卵泡液，PCOS患者卵泡液中分別檢測出167個上調(diào)circRNA和245個下調(diào)circRNA，對其進行功能分析，發(fā)現(xiàn)與細菌感染、慢性炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的通路可被這些差異表達的circRNA靶向調(diào)節(jié)，并且通過構(gòu)建circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)進一步驗證了測序結(jié)果。此外，circRNA-103827對輔助生殖技術(shù)助孕后的妊娠結(jié)局有預(yù)測作用，表明其有著成為新的預(yù)測體外受精-胚胎移植（IVF-ET）結(jié)局的生物標志物的潛力[32]。

3 結(jié)語和展望

CircRNA作為新發(fā)現(xiàn)的RNA家族中的一員，由于其廣泛性和穩(wěn)定性正在成為新的研究熱點，但是對于circRNA的研究還處于起步階段。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名了很多種類的circRNA，但只有少數(shù)circRNA的生物學(xué)功能得以確定，大部分作用機制仍處于研究階段。CircRNA表達與患者臨床特征相關(guān)，參與細胞周期、細胞凋亡、血管形成及侵襲，并作為miRNA海綿參與細胞轉(zhuǎn)移，提示circRNA可能參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，其在輔助生殖胚胎植入、卵泡發(fā)育等方面也發(fā)揮一定作用。CircRNA可以被分泌到細胞外環(huán)境中，臨床可通過非侵入性手段在血液、尿液、組織及分泌物中檢測出circRNA，這意味著將特定circRNA作為生物標志物及疾病預(yù)后指標成為可能。研究人員可以對已知功能的circRNA進行更加細致深入的研究，同時通過發(fā)現(xiàn)各類circRNA的分子作用機制，為疾病的臨床診斷、治療及預(yù)后預(yù)測提供新的依據(jù)和方向。