山梨醇代謝旁路及其在生殖領(lǐng)域研究進(jìn)展

李玲君，張?jiān)脉危挢构?/p>

山梨醇，又名D-葡萄糖醇，是一種六碳多元醇，天然存在于蘋果、梨、桃、杏和一些蔬菜中，具有很高的吸濕性，可防止水分流失，常用于糖果產(chǎn)品中[1]。細(xì)胞內(nèi)的山梨醇代謝旁路，又稱多元醇代謝旁路，是葡萄糖代謝的通路之一，即葡萄糖在醛糖還原酶（AR）催化下生成山梨醇，再經(jīng)過山梨醇脫氫酶（SORD）作用轉(zhuǎn)化為果糖[2]。生理?xiàng)l件下該通路是葡萄糖代謝的補(bǔ)償通路而處于低水平激活狀態(tài)；在高血糖等病理生理學(xué)過程中，細(xì)胞內(nèi)這條通路被異常激活參與葡萄糖代謝，導(dǎo)致山梨醇、果糖積累，糖基化終產(chǎn)物（AGE）形成，細(xì)胞內(nèi)的氧化-還原失衡、活性氧簇（ROS）升高，與多種疾病密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，山梨醇旁路被異常激活是糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制之一，通過某種方式抑制該旁路是有潛在前景的預(yù)防或控制糖尿病慢性并發(fā)癥的手段[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，山梨醇代謝旁路在生殖系統(tǒng)中具有某些作用，盡管目前尚未明確，例如睪丸、附睪及其他附性腺均表達(dá)AR和SORD，提示山梨醇旁路可能的作用[4-5]；山梨醇旁路還與卵母細(xì)胞成熟有關(guān)，在卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）培養(yǎng)液中添加高濃度山梨醇對卵母細(xì)胞成熟產(chǎn)生負(fù)面影響[6-8]。本文介紹細(xì)胞內(nèi)山梨醇代謝旁路及其在生殖領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1 細(xì)胞內(nèi)山梨醇代謝旁路

組織細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝的山梨醇代謝旁路，是由兩種酶催化的兩步反應(yīng)（見圖1），葡萄糖首先在AR的催化下生成山梨醇，同時(shí)將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）轉(zhuǎn)化成為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）；第二步山梨醇在SORD的催化下生成果糖，同時(shí)將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。

圖1細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝的山梨醇旁路

1.1 AR AR為山梨醇代謝旁路的限速酶，屬于醛-酮還原酶超家族的一員，是一種以胞漿NADPH為輔酶的氧化還原酶[9-10]。人類AR由315個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，呈β/α三維桶狀結(jié)構(gòu)，催化活性中心位于桶芯，NADPH輔助因子連接在β/α桶的羧基（—COOH）末端的頂端[9-10]。由于AR與葡萄糖的親和力很低，在血糖正常時(shí)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖大多經(jīng)由糖酵解途徑代謝；山梨醇代謝旁路作為葡萄糖代謝的一條補(bǔ)償通路而處于低水平狀態(tài)，生理?xiàng)l件下該旁路代謝的葡萄糖極少[11]。當(dāng)血糖增高時(shí)，己糖激酶飽和，會刺激AR生成和酶活化，激活山梨醇代謝旁路，增加了葡萄糖通過該旁路的代謝[11]。

葡萄糖并不是AR唯一底物，其他底物還包括異己醛、4-羥基-反式-2-壬醛（4HNE）和4HNE谷胱甘肽加合物（GS-HNE）等[12-13]。異己醛是類固醇激素合成第一步膽固醇氧化分解側(cè)鏈斷裂生成的產(chǎn)物之一，人、狗、兔、猴腎上腺內(nèi)的異己醛主要通過AR代謝[12]。4HNE為脂質(zhì)過氧化主要的終產(chǎn)物之一，細(xì)胞內(nèi)高濃度4HNE可通過c-Jun氨基末端激酶（JNK）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）等多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)，GS-HNE是其代謝的一種中間形式[14]。細(xì)胞內(nèi)ROS升高導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化增加，4HNE升高，4HNE的積累誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)凋亡信號，AR與4HNE反應(yīng)后可降低4HNE和GS-HNE的細(xì)胞毒性[13-14]。

AR還原葡萄糖同時(shí)消耗NADPH。NADPH是還原型谷胱甘肽（GSH）的再生輔助因子，而GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑，NADPH降低會導(dǎo)致GSH消耗進(jìn)而加劇細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激[3]。

1.2 SORD SORD催化山梨醇轉(zhuǎn)化為果糖。SORD屬于中鏈脫氫酶/還原酶蛋白家族。人類SORD為四聚體，每個(gè)亞基由356個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)鋅原子組成，形成兩個(gè)β桶狀結(jié)構(gòu)，兩者之間有縫隙，而催化活性中心位于縫隙的底部[15]。SORD的輔酶結(jié)合域是經(jīng)典的羅斯曼（Rossmann）折疊，可逆性結(jié)合輔助因子NAD+[15]。SORD催化山梨醇2號位碳上的氫對NAD+煙酰胺的4號位碳親核取代，將山梨醇轉(zhuǎn)變成果糖并生成NADH[16]。除D-山梨醇外，SORD底物還包括L-艾杜醇、D-木糖醇和D-半乳糖醇等[17]。

SORD將山梨醇轉(zhuǎn)變?yōu)楣堑耐瑫r(shí)，使細(xì)胞內(nèi)NADH積累。線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ催化2個(gè)電子從NADH轉(zhuǎn)移到醌池，并將質(zhì)子從線粒體內(nèi)泵入膜間隙產(chǎn)生質(zhì)子梯度，為ATP生成做準(zhǔn)備。當(dāng)NADH過高時(shí)，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ不斷將其氧化為NAD+，導(dǎo)致復(fù)合物Ⅰ過載，形成更多超氧化物[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝臟和肌肉線粒體內(nèi)高膜電位的條件下，ROS和NADH同步改變，NADH積累、NAD+/NADH比值下降促進(jìn)ROS生成[19]。

總之，SORD催化山梨醇轉(zhuǎn)變?yōu)楣堑耐瑫r(shí)，NADH積累，ROS生成增多，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化-還原失衡，氧化應(yīng)激增加。

2 山梨醇代謝旁路與相關(guān)疾病

山梨醇代謝旁路與多種疾病有關(guān)，研究最多的是其與糖尿病并發(fā)癥間的聯(lián)系[20-22]。

2.1 糖尿病及其并發(fā)癥 在高血糖狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)30%的葡萄糖通過山梨醇代謝旁路被代謝，該旁路的激活使NADPH減少，NAD+/NADH比值降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化-還原失衡。同時(shí)，反應(yīng)生成的山梨醇和果糖積累，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，細(xì)胞功能受損[3]。果糖及其代謝產(chǎn)物3-磷酸果糖和3-脫氧葡萄糖是比葡萄糖更有效的非酶糖化劑，AGE與其受體結(jié)合也引起氧化應(yīng)激[23]。以上均為糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，如在糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病等微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中，ROS的增高、山梨醇積累、AGE形成，通過氧化應(yīng)激機(jī)制激活蛋白激酶C（PKC），誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子以及不同的炎癥和凋亡信號，破壞微血管，引發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病[20-21]。

研究糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)施旺細(xì)胞內(nèi)山梨醇代謝旁路高激活，山梨醇和果糖濃度增加，細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)流出，影響細(xì)胞功能。細(xì)胞內(nèi)山梨醇和果糖積累，還降低肌醇和牛磺酸濃度，因此抑制Na+-K+泵，使細(xì)胞內(nèi)Na+積累導(dǎo)致軸突和軸索腫脹，神經(jīng)膠質(zhì)功能障礙和神經(jīng)傳導(dǎo)速度（NCV）降低。此外，AR消耗NADPH和GSH；SORD使細(xì)胞內(nèi)NADH積累、NAD+/NADH比值減小，導(dǎo)致血管內(nèi)皮神經(jīng)損傷及NO介導(dǎo)的血管舒張功能喪失；該通路還使神經(jīng)、脊髓和背根神經(jīng)節(jié)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性升調(diào)節(jié)，在糖尿病神經(jīng)病變中起著重要作用[22]。

有研究顯示，阿爾茨海默病腦區(qū)的山梨醇和果糖濃度顯著升高，提示山梨醇代謝旁路被激活，可能與阿爾茲海默病神經(jīng)病變有關(guān)[24]。今后需要更多研究探討山梨醇代謝旁路在其發(fā)生發(fā)展中的作用。

2.2 缺血/再灌注（I/R）損傷 研究顯示，山梨醇代謝旁路在I/R損傷中起負(fù)面效應(yīng)。脂肪肝小鼠模型的肝臟I/R處理，與對照組相比，腹腔注射AR抑制劑后能減少I/R引起的NADPH損失、改善氧化-還原失衡、顯著增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞瘤2（bcl-2）和其與Bcl-2相關(guān)X蛋白比值（bcl-2/bax）、抑制caspase-3活化、提高GSH胞漿含量、降低丙二醛（MDA），因此明顯減低I/R損傷。人L02肝細(xì)胞系高表達(dá)AR后再采取缺氧/復(fù)氧（H/R）的處理，與未誘導(dǎo)AR高表達(dá)的對照組相比，細(xì)胞內(nèi)MDA增多，肝細(xì)胞膜受損程度增高，線粒體膜電位水平被破壞，細(xì)胞凋亡增加。提示山梨醇代謝旁路會增加肝細(xì)胞對I/R事件的敏感性，小分子AR抑制劑則通過抑制山梨醇代謝旁路可能成為脂肪肝缺血/再灌注損傷中保護(hù)肝臟的有效輔助方法[25]。

正常小鼠肝臟I/R處理同時(shí)應(yīng)用SORD抑制劑，能顯著減輕I/R引起的肝臟組織學(xué)改變和肝細(xì)胞損傷。抑制SORD活性，逆轉(zhuǎn)了I/R引起的NAD+/NADH失衡，降低I/R誘導(dǎo)的ROS和氧化應(yīng)激，抑制肝細(xì)胞Caspase-3激活；同時(shí)，糖酵解途徑關(guān)鍵酶3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）發(fā)揮催化反應(yīng)依賴NAD+同步還原為NADH，應(yīng)用SORD抑制劑有益于恢復(fù)NAD+/NADH的平衡，使葡萄糖更多地從糖酵解途徑代謝，增加ATP生成，逆轉(zhuǎn)I/R引起的能量虧損。故SORD抑制劑和AR抑制劑一樣也可能成為保護(hù)肝缺血/再灌注組織損傷的輔助方法[26]。

心肌細(xì)胞I/R早期，AR活性升高、山梨醇代謝旁路高激活，可通過抑制β-連環(huán)蛋白（β-catenin）急性激活抑制內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EndMT），從而抑制心肌修復(fù)[27]。

2.3 腫瘤發(fā)生及侵襲性 在人結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌細(xì)胞系，AR表達(dá)降低，SORD表達(dá)上調(diào)，提示山梨醇代謝旁路可能與腫瘤發(fā)生過程的細(xì)胞代謝重構(gòu)有關(guān)[28]。目前尚缺乏細(xì)致的作用及機(jī)制研究。在NCL-60癌細(xì)胞系中基因陣列分析顯示，AR與上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）主要調(diào)節(jié)鋅指轉(zhuǎn)錄因子1（ZEB1）密切相關(guān)；乳腺癌細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系在ZEB1敲除后AR也顯著減低。肺癌細(xì)胞系和卵巢癌細(xì)胞系抑制AR表達(dá)后，EMT及腫瘤生長均受到抑制，敲低SORD出現(xiàn)類似結(jié)果；高濃度葡萄糖致多元醇代謝旁路異常激活，后者刺激轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）相關(guān)信號通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞系EMT[29]。

3 山梨醇代謝旁路與雄性生殖

在生殖系統(tǒng)，山梨醇代謝旁路也起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸支持細(xì)胞高表達(dá)AR，生精細(xì)胞不表達(dá)；生精細(xì)胞表達(dá)SORD，支持細(xì)胞不表達(dá)[4]。腎上腺中的AR能代謝膽固醇側(cè)鏈裂解副產(chǎn)物異己醛[12]，而睪丸精子發(fā)生過程中精子胞質(zhì)和脂質(zhì)膜的丟失過程需要處理膽固醇，故推測支持細(xì)胞高表達(dá)AR，主要功能是處理異己醛、脂醛等膽固醇代謝的副產(chǎn)物。

豬附睪液的葡萄糖、果糖不斷變化，在附睪頭較高、在附睪尾較低，而山梨醇濃度在附睪管中相對穩(wěn)定。附睪尾部低葡萄糖、果糖，可能是由于儲存于附睪的精子利用葡萄糖和果糖作為能量物質(zhì)而代謝所致；山梨醇在附睪管不同區(qū)段相對均勻分布，提示其可能參與維持附睪液滲透壓以維持精子頭部形態(tài)，而不是能量物質(zhì)[30]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，牛的附睪上皮細(xì)胞高表達(dá)AR、SORD，且附睪頭、體、尾AR和SORD的表達(dá)及活性存在差異，AR蛋白及酶活性在附睪尾部較低（相對于頭、體部），SORD蛋白和酶活性在附睪尾較高（相對于頭、體部），這有利于山梨醇向果糖轉(zhuǎn)化，而果糖更易于進(jìn)入糖酵解產(chǎn)生能量，其為儲存在附睪尾的精子提供能量[31]。

不完全等同于牛的研究，人附睪頭、體、尾均表達(dá)AR和SORD，且在各區(qū)段相對均勻，主要出現(xiàn)于附睪上皮細(xì)胞的頂端。這種差異可能是人類附睪獨(dú)特的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)所致，與牛相比，人類附睪尾發(fā)育不良，精子儲存能力低下，故附睪中山梨醇旁路可能發(fā)揮其他作用[5]。

山梨醇和果糖是人類、豬、大鼠、公羊精液的組成成分，為精子活動的能量來源之一[5,30]。人附睪小體和前列腺小體內(nèi)有AR和SORD表達(dá)，在牛附睪小體內(nèi)，AR為主要酶之一[5,31]。還有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠精子從附睪頭向尾運(yùn)行時(shí)，附睪上皮細(xì)胞的AR會通過附睪小體轉(zhuǎn)移到精子上，這種“傳遞”具體作用尚不清楚，可能與精子活動有關(guān)[4]。

綜上，山梨醇代謝旁路可能參與精子發(fā)生過程和成熟過程：①支持細(xì)胞AR可能參與代謝與清除精子發(fā)生過程中膽固醇側(cè)鏈裂解所產(chǎn)生的有毒醛類；②附睪內(nèi)葡萄糖、山梨醇、果糖可能參與精子成熟和儲存，精液中山梨醇、果糖也是精子能量來源之一；③附睪小體、前列腺小體介導(dǎo)附性腺與精子之間的AR、SORD運(yùn)輸，這種“傳遞”可能與精子活動有關(guān)。

4 山梨醇代謝旁路與雌性生殖

卵母細(xì)胞成熟過程有4種糖代謝的方式：糖酵解、磷酸戊糖途徑、己糖胺生物合成途徑和山梨醇代謝旁路[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞均有AR和SORD的表達(dá)，且卵母細(xì)胞通常高表達(dá)AR和SORD，表明山梨醇代謝旁路在卵母細(xì)胞發(fā)育與成熟中有某種重要作用[32]。

卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)由中期促進(jìn)因子（MPF）觸發(fā)[33]。卵母細(xì)胞MPF是由一個(gè)催化亞基和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基組成的蛋白復(fù)合物，前者是細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶1（Cdk 1），后者是細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1）。卵泡刺激素（FSH）與顆粒細(xì)胞上的FSH受體結(jié)合，使卵母細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量激增，調(diào)控卵母細(xì)胞MPF的活性，對于恢復(fù)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂很關(guān)鍵[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠中FSH不能有效刺激卵母細(xì)胞成熟[35]。那么，糖尿病小鼠卵母細(xì)胞對FSH低反應(yīng)性是否是由于山梨醇代謝旁路異常激活？有學(xué)者將正常小鼠和糖尿病小鼠的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（COC）分別在含F(xiàn)SH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)添加不同濃度的山梨醇，比較生發(fā)泡破裂（GVBD）發(fā)生率，結(jié)果表明山梨醇以劑量依賴的方式抑制FSH誘導(dǎo)的減數(shù)分裂和卵母細(xì)胞成熟；正常小鼠和糖尿病小鼠的COC在含F(xiàn)SH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不添加外源性山梨醇，各自分別添加了AR抑制劑和AR激動劑，結(jié)果表明抑制AR后糖尿病小鼠COC被抑制的GVBD發(fā)生率得到改善，添加AR激動劑后正常小鼠COC的FSH促進(jìn)GVBD作用被抑制，同時(shí)降低cAMP產(chǎn)生。提示了山梨醇代謝旁路對激素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂具有抑制作用，因?yàn)樯嚼娲紲p少了FSH誘導(dǎo)的cAMP生成[6]。

奶牛子宮液含較高的山梨醇，低水平山梨醇可導(dǎo)致奶牛不孕[32]。研究發(fā)現(xiàn)，牛和大鼠的輸卵管局部存在差異表達(dá)的AR和SORD，作用尚不明確，可能與配子儲存、精子獲能并完成受精、早期胚胎發(fā)育等事件有關(guān)[36]。

Lin等[7]研究了山梨醇對豬早期胚胎發(fā)育的影響，在體外培養(yǎng)液中添加不同濃度的山梨醇，觀察其對豬卵母細(xì)胞成熟和囊胚形成的影響，并分析卵母細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH含量，發(fā)現(xiàn)在添加較高濃度的山梨醇時(shí)，卵母細(xì)胞內(nèi)ROS增高，卵母細(xì)胞成熟率、卵丘細(xì)胞擴(kuò)張均降低，囊胚形成率顯著降低，胚胎的細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，說明較高濃度的山梨醇對卵母細(xì)胞質(zhì)量和早期胚胎發(fā)育均有負(fù)面影響。Yamauchi等[8]發(fā)現(xiàn)，IVM培養(yǎng)液添加一定濃度山梨醇升高培養(yǎng)液的滲透壓，卵母細(xì)胞GVBD發(fā)生率降低，卵母細(xì)胞成熟減少。

因此，IVM培養(yǎng)液添加外源性山梨醇，可能通過三個(gè)方面影響卵母細(xì)胞成熟：①減少FSH誘導(dǎo)cAMP增高和新嘌呤合成；②減少GSH，增加卵母細(xì)胞ROS和氧化應(yīng)激；③升高了IVM培養(yǎng)液的滲透壓。

5 總結(jié)和展望

山梨醇代謝旁路的異常激活，與糖尿病慢性并發(fā)癥密切相關(guān)，已合成多種小分子AR抑制劑以對應(yīng)不同的糖尿病并發(fā)癥，如針對糖尿病眼病的索比尼爾（sorbinil）、針對糖尿病神經(jīng)病變的槲皮素（quercetin）等，抑制高血糖所致山梨醇代謝旁路異常激活，有望進(jìn)入臨床用于預(yù)防和治療糖尿病慢性并發(fā)癥[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，山梨醇代謝旁路在生殖系統(tǒng)也發(fā)揮重要作用，人和公羊、牛、豬等動物精液中山梨醇和果糖可作為精子活動的能量來源物質(zhì)，睪丸支持細(xì)胞AR參與清除精子發(fā)生過程的有毒代謝產(chǎn)物。在雌（女）性，山梨醇代謝旁路與卵母細(xì)胞成熟有關(guān)，在IVM培養(yǎng)液中添加較大濃度山梨醇對卵母細(xì)胞成熟產(chǎn)生負(fù)面影響，可能與減少FSH誘導(dǎo)的cAMP生成、提高卵母細(xì)胞內(nèi)ROS、升高培養(yǎng)液滲透壓等有關(guān)。研究山梨醇代謝旁路在生殖系統(tǒng)的作用，對于進(jìn)一步闡明配子發(fā)生與成熟、提高IVM培養(yǎng)液效能具有重要意義。