Rab35蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究進(jìn)展*

賀玲， 張小燕， 楊雅芝， 李劍△

1江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院(江西南昌 330052)； 2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院(江西南昌 330006)； 3南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江西南昌 330006)

Rab蛋白作為Ras超家族中有鳥(niǎo)苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase，GTPase)功能的成員，對(duì)維持真核細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、外泌體分泌等有調(diào)節(jié)作用，近年來(lái)有研究顯示Rab蛋白與腫瘤關(guān)系密切，尤其在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用[1]。目前已知人類Rab蛋白超過(guò)60多種。Rab35作為RabGTPase家族成員之一，功能上是一種運(yùn)輸?shù)鞍祝诩?xì)胞內(nèi)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)戎匾^(guò)程，特別是在細(xì)胞內(nèi)吞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起分子開(kāi)關(guān)的關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)報(bào)道[2]，Rab35在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等腫瘤中高表達(dá)，而在其他腫瘤中的作用未見(jiàn)系統(tǒng)的報(bào)道，現(xiàn)就Rab35在腫瘤細(xì)胞中的膜運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分裂及細(xì)胞遷移的作用進(jìn)展做一綜述。為進(jìn)一步探尋Rab蛋白對(duì)腫瘤發(fā)生，發(fā)展中所起的作用奠定基礎(chǔ)。

1 Rab35生物學(xué)特性

Rab家族蛋白是小分子三磷酸鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白中最大的亞家族成員，幾乎表達(dá)于所有真核細(xì)胞生物。Rab蛋白是一種高度保守的GTP結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)所有真核細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸。Rab蛋白作為非活性GDP和活性GTP形式之間的分子開(kāi)關(guān)，后者與特定的細(xì)胞膜相互作用，并控制下游效應(yīng)器的局部募集。鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)和GTPase激活蛋白(GAP)分別調(diào)節(jié)Rab激活和失活。更重要的是，Rab蛋白還控制著生長(zhǎng)因子受體的內(nèi)吞、回收和降解，其中包括一些在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的生長(zhǎng)因子受體，如：表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)[3]，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)[4]，c-Met13和整合素[5]。通過(guò)調(diào)控這些受體的內(nèi)吞運(yùn)輸和循環(huán)，來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活也許將成為未來(lái)腫瘤治療的靶點(diǎn)。例如，在內(nèi)涵體中，藥物誘導(dǎo)的EGFR累積可選擇性地激活腫瘤細(xì)胞的凋亡。這說(shuō)明靶向內(nèi)吞運(yùn)輸過(guò)程來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是可能的。有越來(lái)越多的證據(jù)表明Rab蛋白在腫瘤進(jìn)展中起著重要的作用。

Rab35蛋白是一種被描述為參與內(nèi)吞循環(huán)和胞質(zhì)分裂的GTP結(jié)合蛋白。Rab35含有進(jìn)化上高度保守的多堿基C末端尾部，并定位于質(zhì)膜和內(nèi)體上。其多堿基C末端尾部與質(zhì)膜上的PtdIns(4,5)P2和PtdIns(3,4,5)P3相互作用，在細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、自噬、細(xì)胞極性、細(xì)胞分裂、細(xì)胞膜脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)、免疫、吞噬、病原體感染、成肌細(xì)胞融合、外泌體分泌、維貝爾氏體分泌等多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮功能[6]。

2004年美國(guó)科學(xué)家Crockett首次發(fā)現(xiàn)Rab35與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。其研究結(jié)果顯示R35可與致癌性核磷蛋白-間變性淋巴瘤融合激酶(NPM-ALK)52和p53相關(guān)蛋白激酶(PRPK)相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)PRPK介導(dǎo)的p53轉(zhuǎn)錄活性[7]。然而，基于這些相互作用的進(jìn)一步研究尚未報(bào)道。最新研究[4]表明人類腫瘤細(xì)胞中Rab35基因發(fā)生突變，該突變可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞具有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Rab35是通過(guò)活化PI3K/AKT通路來(lái)增加PDGFR受體回收的，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的PDGFR受體增多，啟動(dòng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程[8]。既往研究顯示Rab35還可通過(guò)控制細(xì)胞分裂、極性和遷移以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程，在腫瘤進(jìn)展的多個(gè)方面起重要作用[9]。

2 Rab35與細(xì)胞分裂

細(xì)胞分裂和細(xì)胞極性化是腫瘤細(xì)胞容易失去控制的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，Rab35在兩者中都起重要作用。Pylypenko等[10]在篩選果蛹S2細(xì)胞中Rab蛋白(一種對(duì)胞質(zhì)分裂有重要作用的蛋白)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Rab35為一種能導(dǎo)致最強(qiáng)的胞質(zhì)分裂缺陷表型(雙核細(xì)胞)的蛋白。研究顯示敲除Rab35將產(chǎn)生雙核細(xì)胞并擾亂了快速的內(nèi)體回收途徑。第一個(gè)分離得到的Rab35效應(yīng)器是OCRL[PtdIns(4,5)P2 phosphatase Oculo-Cerebro-Renal syndrome of Lowe][11]，其在細(xì)胞分裂過(guò)程中能促進(jìn)子細(xì)胞從母細(xì)胞成功脫落。另一種Rab35效應(yīng)物MICAL1[12]，可通過(guò)氧化作用解聚F-肌動(dòng)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞間橋上的內(nèi)吞體運(yùn)輸分揀復(fù)合物(ESCRT)-Ⅲ募集，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分裂。OCRL和MICAL1都以Rab35依賴的方式定位于細(xì)胞間橋，并且它們的消耗將導(dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白在該位置累積。這表明兩者協(xié)同地解聚了細(xì)胞間橋上F-肌動(dòng)蛋白，這對(duì)于胞質(zhì)分裂的成功進(jìn)行似乎是必不可少的。重要的是，研究已經(jīng)證實(shí)，在原代小鼠乳房上皮細(xì)胞中出現(xiàn)雙核細(xì)胞將促進(jìn)小鼠體內(nèi)的腫瘤發(fā)生[2]。Rab35及其效應(yīng)子除了在胞質(zhì)分裂中的作用之外，Rab35還在協(xié)調(diào)細(xì)胞極性化和正常的形態(tài)形成過(guò)程中起重要作用。細(xì)胞的極性形成對(duì)細(xì)胞發(fā)育、分化及其正常的生理功能發(fā)揮著舉足輕重的作用, 細(xì)胞極性的喪失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[13]，Rab35通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)姆绞?，將含有重要的頂端蛋白[如Cdc42、Crumbs3、aPKC和GP135/Podocalyxin(PODXL)]的囊泡特異性地“銜羈”到頂端膜起始位點(diǎn)(apical membrane initiation site，AMIS)，形成細(xì)胞的apico-basal極性。因此，Rab35表達(dá)下調(diào)或失活可防止AMIS和偽足管腔的形成，并導(dǎo)致apico-basal極性完全反轉(zhuǎn)。由于apico-basal極性的變化被認(rèn)為有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這表明Rab35功能缺失可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。有趣的是，已發(fā)現(xiàn)Rab35在Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和腎癌等腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)或突變[14]。

3 Rab35與膜運(yùn)輸和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)

Rab35通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)各種“內(nèi)容物”的內(nèi)吞循環(huán)在胞內(nèi)運(yùn)輸中起著重要的作用，這些“內(nèi)容物”包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)、卵黃受體、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(MHC-Ⅰ)、MHC-Ⅱ、T細(xì)胞受體、Ca2 +激活的K+通道KCa2.3、巨蛋白、GLUT4、M-和N-鈣粘著蛋白和β1-整合素等[15-22]。此外，敲除Rab35將抑制CI-甘露糖-6-磷酸受體從內(nèi)體向反式高爾基網(wǎng)絡(luò)(trans Golgi network，TGN)的運(yùn)輸[23]。最近的研究表明，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，腫瘤抑制因子濾泡素(tumor suppressor folliculin，F(xiàn)LCN)能通過(guò)DENN(differentially expressed in normal and neoplastic cells，DENN)結(jié)構(gòu)域與Rab35結(jié)合，此時(shí)，F(xiàn)LCN具有GEF(guanine nucleotide exchange factor，GEF)活性。單獨(dú)干擾FLCN或Rab35均可明顯減少EGFR的降解，同時(shí)下游信號(hào)分子AKT和ERK的活性明顯增強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)[24]。EGFR的高表達(dá)及激活的PI3K-AKT和ERK-RSK等信號(hào)通路促進(jìn)惡性腫瘤的增殖、生長(zhǎng)、存活和遷移。Rab35在很多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)及突變，如在肺癌、宮頸癌中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)Rab35活化突變點(diǎn)A151T和F161L。這種突變可調(diào)節(jié)富含PDGFR-α的囊泡運(yùn)輸，激活mTORC2/PI3K/AKT信號(hào)通路，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞進(jìn)行“上皮-間質(zhì)”轉(zhuǎn)化和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[25-26]。然而，這些過(guò)程的具體機(jī)制依舊不清楚。在胞質(zhì)分裂過(guò)程中，Rab35-GTP與OCRL脂質(zhì)磷酸酶結(jié)合，促進(jìn)新生內(nèi)體/包裹網(wǎng)格蛋白的囊泡上的PtdIns(4,5)P2水解，這促進(jìn)了內(nèi)體上PtdIns4P的產(chǎn)生，這是細(xì)胞內(nèi)的“內(nèi)容物”分選和質(zhì)膜回收或靶向跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)的重要步驟[27]。除了維持PtdIns4P與PtdIns(4,5)P2穩(wěn)態(tài)之外，活性Rab35還可調(diào)節(jié)PtdIns(3,4,5)P3水平及活化AKT。因此，Rab35-GTP的異常水平可影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)體的脂質(zhì)組成及生長(zhǎng)因子受體命運(yùn)。另外，Rab35還可通過(guò)募集另外兩種效應(yīng)物ARF6-GAP ACAP2/CentaurinB2和MICAL-L1，控制ARF6陽(yáng)性內(nèi)體的“內(nèi)容物”回收到質(zhì)膜[28]。

4 Rab35與細(xì)胞遷移

細(xì)胞遷移和擴(kuò)散在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。大量研究表明Rab35通過(guò)介導(dǎo)的“貨物”回收來(lái)調(diào)控細(xì)胞遷移。在COS-7細(xì)胞中敲除Rab35可誘導(dǎo)細(xì)胞形成EMT特征表型，增加細(xì)胞的遷移和降低細(xì)胞-細(xì)胞間黏附[29]。此外，Rab35與ARF6蛋白特異性的GAP 酶激活蛋白ACAP258相互作用抑制ARF6介導(dǎo)的β1整合素的回收，所以敲除Rab35會(huì)增加細(xì)胞表面的β1整合素水平，并因此促進(jìn)細(xì)胞遷移[30]。2013年沈恬等[31]發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中Rab35被Wnt信號(hào)通路激活后，細(xì)胞中骨架蛋白重組形成細(xì)胞偽足促進(jìn)遷移；干擾乳腺腫瘤細(xì)胞中Rab35的表達(dá)后，細(xì)胞的遷移能力明顯降低。2015年[32]，Rab35在卵巢癌中被確定為miR-720的直接靶標(biāo)，miR-720通過(guò)下調(diào)Rab35促進(jìn)細(xì)胞遷移，miR-720也早已證實(shí)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。2016年鄧文杰等[33]發(fā)現(xiàn)，EGF可介導(dǎo)Rab35激活，激活后的Rab35可與 MICAL1酶結(jié)合，可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞活性氧(ROS)產(chǎn)生增多，AKT磷酸化和細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)。進(jìn)一步研究顯示MICAL1結(jié)合Rab35-GTP后導(dǎo)致抑制性分子內(nèi)折疊，激活MICAL1的氧化還原活性并選擇性地解聚F-肌動(dòng)蛋白，眾所周知肌動(dòng)蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移中有著重要的作用。然而Rab35在侵襲期間是否重塑肌動(dòng)蛋白有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。與上述研究結(jié)果相反的是，在非小細(xì)胞肺癌中，持續(xù)活化的EGF可激活Rab35，降低了G蛋白偶聯(lián)受體激酶與其配體ARFGAP2(GIT2)和RUSC2之間的相互作用，降低了細(xì)胞遷移能力[34]。這些看似矛盾的結(jié)果表明，或許在不同的腫瘤中，Rab35在其遷移與侵襲中起不同的作用。

5 展望

Rab家族作為Ras超家族的成員，發(fā)揮著重要的細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)功能。而Rab35作為新型GTP結(jié)合蛋白，參與膜運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞遷移等過(guò)程，其表達(dá)異?？赡軙?huì)引發(fā)多種細(xì)胞器缺陷和功能紊亂。尤其Rab35在腫瘤中的作用逐漸被關(guān)注，但其作用于腫瘤細(xì)胞的潛在機(jī)制、是否有預(yù)后價(jià)值及能否成為腫瘤治療新型靶點(diǎn)尚不明了；另外Rab35作為非常規(guī)分泌蛋白及參與胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),與胞外基質(zhì)蛋白調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境是否存在協(xié)同作用？其調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移是否存在多條信號(hào)通路？其具體機(jī)制均需后續(xù)大量研究驗(yàn)證。總之，隨著高通量測(cè)序、基因芯片技術(shù)的發(fā)展和腫瘤相關(guān)Rab分子的快速檢測(cè)，Rab35有望成為腫瘤潛在分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)之一，為腫瘤診斷和靶向治療提供新的研究方向。